Sviluppo di coniugati acido ialuronico-idrocortisone per uso oftalmico nella sindrome dell’occhio secco: sintesi, caratterizzazione e valutazione della stabilità

Dry Eye Disease (DED) is a chronic and multifactorial condition that affects the functional unit of the ocular surface. When the balance of the tear film is altered, hyperosmolarity, inflammatory processes, and epithelial damage may occur, compromising visual comfort and ocular health. Among the currently available therapies, corticosteroids represent one of the most effective options due to their anti-inflammatory and immunomodulatory action. However, the prolonged use of these drugs is often limited by the occurrence of adverse effects, such as increased intraocular pressure or lens opacification. These complications are largely due to the ability of the active substance to diffuse into the anterior chamber of the eye. Since DED generally requires long-term treatment, a promising approach is to conjugate the corticosteroid with a biocompatible polymer, in order to maintain the therapeutic efficacy of the drug on the corneal surface and to decrease the absorption of the corticosteroid through the cornea, thereby minimizing the risks associated with its prolonged use over time. The aim of this thesis is to synthesize and characterize a series of hyaluronic acid–linker–hydrocortisone (HA–linker–Hyc) conjugates, employing various linear and bifunctional molecules as linkers. The obtained derivatives were then formulated in aqueous solution at the desired concentrations, yielding prototype eye drops to evaluate their stability over time through accelerated tests conducted at 55 °C for one month, in order to estimate the long-term stability of the final formulation at 25 °C. To achieve this goal, several HA–linker-Hyc derivatives were synthesized using chemical linkers of different nature. The synthesis procedure, common to all conjugates, consisted of several distinct steps. In the first step, the selected linker was reacted with hydrocortisone to obtain a reactive intermediate containing the active compound. Subsequently, this intermediate was conjugated to hyaluronic acid through esterification reactions, using the tetrabutylammonium salt of HA as a precursor to promote polymer solubilization and activation of the carboxyl group. Once the HA–linker–Hyc conjugate was obtained, the product was purified by precipitation, followed by repeated washing with a hydroalcoholic mixture. This step was essential to ensure the absence of free hydrocortisone in the final formulation of the experimental eye drop. The obtained products were characterized by ¹H-NMR spectroscopy, which allowed the determination of successful functionalization and of the molar degree of substitution (DSₘₒₗ), ranging between 5% and 15% mol/mol. The presence of unbound hydrocortisone and hydrocortisone-linker not conjugated to HA was quantified by HPLC-UV/Vis analysis. The conjugates showing the most suitable DSₘₒₗ values were subsequently formulated in aqueous solution at two different pH values, as artificial tears, and evaluated for stability and potential therapeutic application in the treatment of DED. At the end of the screening of these derivatives, one HA–linker–Hyc prototype was identified, characterized by good solubility in an aqueous environment and satisfactory stability under the tested conditions.

La sindrome dell’occhio secco (Dry Eye Disease, DED) è una condizione cronica e multifattoriale che interessa l’unità funzionale della superficie oculare. Quando l’equilibrio del film lacrimale si altera, si possono generare iperosmolarità, processi infiammatori e danni epiteliali che compromettono il comfort visivo e la salute dell’occhio. Tra le terapie oggi disponibili, i corticosteroidi rappresentano una delle opzioni più efficaci grazie alla loro azione antinfiammatoria e immunomodulante. Tuttavia, l’uso prolungato di questi farmaci è spesso limitato dalla comparsa di effetti indesiderati, come l’aumento della pressione intraoculare o l’opacizzazione del cristallino. Tali complicanze sono in gran parte dovute alla capacità del principio attivo di diffondersi nella camera anteriore dell’occhio. Poiché la DED richiede nella maggior parte dei casi un trattamento continuativo, una strada promettente è quella di coniugare il corticosteroide con un polimero biocompatibile, al fine di mantenere l’efficacia terapeutica del farmaco sulla superfice corneale e diminuire l’assorbimento del corticosteroide attraverso la cornea riducendo al minimo i rischi legati al loro impiego prolungato nel tempo. L’obiettivo di questo lavoro di tesi è quello di sintetizzare e caratterizzare una serie di coniugati acido ialuronico–linker–idrocortisone (HA–linker–Hyc), impiegando diverse molecole lineari e bifunzionali come linker. I derivati ottenuti sono stati poi formulati in soluzione acquosa alle concentrazioni desiderate, ottenendo dei prototipi di colliri al fine di valutarne la stabilità nel tempo con prove accelerate condotte a 55 °C per 1 mese, al fine di stimare la stabilità a lungo termine a 25 °C del formulato finale. Per il raggiungimento di tale obiettivo, sono stati sintetizzati diversi derivati HA–linker–Hyc impiegando linker chimici di natura differente. La procedura di sintesi, comune a tutti i coniugati, è stata articolata in più fasi distinte. Nel primo step, il linker selezionato è stato fatto reagire con l’idrocortisone, allo scopo di ottenere un intermedio reattivo contenente il principio attivo. Successivamente, tale intermedio è stato coniugato all’acido ialuronico mediante reazioni di esterificazione, utilizzando come precursore il sale di tetrabutilammonio dell’HA, impiegato per favorire la solubilizzazione del polimero e l’attivazione del gruppo carbossilico. Una volta ottenuto il coniugato HA–linker–Hyc, il prodotto è stato purificato per precipitazione, seguito da ripetuti lavaggi con una miscela idroalcolica. Tale passaggio è stato fondamentale per garantire l’assenza di idrocortisone libero nella formulazione finale del collirio sperimentale. I prodotti ottenuti sono stati caratterizzati con spettroscopia ¹H-NMR. Ciò ha permesso di determinare l’avvenuta funzionalizzazione e il grado di sostituzione molare (DSₘₒₗ), variabile tra il 5% e il 15% mol/mol. La presenza di idrocortisone e idrocortisone-linker non legati all’HA è stata invece quantificata mediante HPLC-UV/Vis. I coniugati che hanno mostrato i valori di DSmol più adeguati sono stati successivamente formulati in soluzione acquosa a due diversi pH, come lacrime artificiali, e destinati alla valutazione della stabilità e del potenziale impiego terapeutico nel trattamento della DED. Al termine dello screening di questi derivati è stato identificato un prototipo HA–linker–Hyc caratterizzato da buona solubilità in ambiente acquoso e stabilità soddisfacente nelle condizioni testate.