Il ruolo del microbiota nella risposta della vongola verace (Ruditapes philippinarum) alle Marine Heat Waves (MHWs): un focus sui test biochimici e molecolari

The effects of climate change (CC) represent one of the main challenges of our time, with repercussions also on marine ecosystems. Over the last two decades, there has been observed an increase in the frequency and duration of Marine Heat Waves (MHWs: anomalous rises in seawater temperature persisting over prolonged periods). The Mediterranean is one of the seas most heavily impacted by this phenomenon, which is warming at a rate 20% higher than the global average. These extreme events have a direct impact on the biodiversity of numerous benthic species, among which the Ruditapes philippinarum (Manila clam), a bivalve mollusk native to the western Pacific and later introduced into North America and Europe for aquaculture purposes, is one of the most affected. These organisms, which are suspension-feeding microfilterers, play a key ecological role in water filtration and hold significant economic importance: Italy is the leading European producer, followed by Spain and France. As a result, MHWs in the Mediterranean have a negative impact on the overall economic growth of sectors, including mollusk farming. Exposure to thermal stress can compromise growth, reproduction, survival (mass mortality), metabolism, and immune system of clams, while also increasing their susceptibility to pathogens. In this context, the microbiota plays a crucial role in maintaining overall host health (supporting the immune system, modulating metabolism and physiology), contributing to homeostasis and resistance to environmental stressors. The underlying concept is the dynamic nature of the microbiota in bivalve mollusks due to their filter-feeding lifestyle and interaction with the surrounding environment. Recent studies investigate the relationship between microbiota and heat tolerance, highlighting how extreme heat waves exposure alters microbial composition and decrease alpha diversity. The main objective of this research project is to evaluate the role of the microbial community associated with the host in modulating tolerance and survival during MHWs events. In particular, it was tested whether the transplantation of a microbiota previously adapted to sub-lethal heat stress could confer a benefit to the host. The methodology applied was microbiota transplantation: two batches of clams subjected to microbial depletion using a mix of antibiotic treatment, received respectively a microbiota from clams subjected to a Priming treatment (7 days at 30 °C) or a Control treatment (7 days at 25 °C). This thesis aimed to test the efficiency of the transplantation by evaluating the activity of three antioxidant enzymes: superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GPx), known to increase under oxidative stress conditions induced by HWs. Additionally, total protein content and lipid peroxidation (LP) levels were assessed by quantifying malondialdehyde (MDA). The results show that clams with heat-primed microbiome exposed to HWs have higher SOD and CAT activity compared to those with control microbiome. On the other hand, no significant differences were observed for GPx activity, but a trend can still be noted. During the study, molecular analyses were also performed. Specifically, a qPCR assay targeting the 16S gene was carried out, in order to highlight potential differences or variations in relative microbial abundance between the two groups, and 16S rRNA amplicon sequencing was performed to obtain data on microbial diversity (alpha diversity calculated using the Observed index). Finally, the analyses revealed significant changes in bacterial load and in the number of taxa following the different treatments, as well as differences between the experimental groups.

Gli effetti dei cambiamenti climatici (CC) rappresentano una delle principali criticità del nostro tempo, con ripercussioni anche sugli ecosistemi marini. Negli ultimi due decenni è stato osservato un incremento nella frequenza e nella durata delle Marine Heat Waves (MHWs): aumento anomalo della temperatura delle acque per un periodo prolungato. Tra le aree maggiormente colpite da questo fenomeno troviamo il Mediterraneo, che si riscalda a una velocità superiore del 20% rispetto alla media globale. Questi eventi estremi hanno impatto diretto sulla biodiversità di numerose specie bentoniche. Tra le specie maggiormente colpite troviamo la vongola verace Ruditapes philippinarum (vongola filippina), mollusco bivalvo originario del Pacifico occidentale introdotto poi anche in Nord America ed Europa per finalità di acquacoltura. Questi organismi, microfiltratori sospensivori, svolgono un ruolo ecologico fondamentale nella filtrazione dell’acqua e rivestono un importante ruolo economico: l’Italia è il primo produttore europeo, seguita da Spagna e Francia. Si deduce che le MHWs nel Mediterraneo influenzano negativamente la crescita economica complessiva di settori come la molluschicoltura. L’esposizione a stress termici può compromettere crescita, riproduzione, sopravvivenza (mortalità di massa), metabolismo e sistema immunitario delle vongole, aumentandone la suscettibilità a patogeni. In questo contesto il microbiota riveste un ruolo cruciale nel mantenimento della salute generale dell'ospite (supporta il sistema immunitario, modula il metabolismo e la fisiologia), contribuendo all’omeostasi e alla resistenza agli stress ambientali. Il concetto alla base è la dinamicità del microbiota dei molluschi bivalvi per via della loro natura di filtratori e quindi dell’interazione con l’ambiente circostante nonché dalle caratteristiche intrinseche dell’ospite. La ricerca si è concentrata recentemente sul legame tra microbiota e tolleranza al calore, evidenziando come l’esposizione a ondate di calore estreme influisce e modifica la composizione microbica, portando a una diminuzione dell’alpha diversity. L’obiettivo principale di questo progetto di ricerca è valutare il ruolo della comunità microbica associata all’ospite nel modulare la tolleranza e la sopravvivenza durante eventi di MHWs. In particolare, è stato testato se il trapianto di un microbiota precedentemente adattato a uno stress termico sub-letale potesse conferire un beneficio all’ospite. La metodologia utilizzata è stata il trapianto di microbiota: due lotti di vongole sottoposte a deplezione microbica tramite un mix di antibiotici hanno ricevuto rispettivamente un microbiota proveniente da vongole sottoposte a un trattamento di Priming (7 giorni a 30 °C) oppure di Controllo (7 giorni a 25 °C). Con il presente lavoro di tesi si è andati a testare l’efficienza del trapianto valutando l’attività di tre enzimi antiossidanti: superossido dismutasi (SOD), catalasi (CAT), glutatione perossidasi (GPx), noti per aumentare in condizioni di stress ossidativo da HWs. Si sono anche valutati il contenuto proteico totale e i livelli di perossidazione (LP) tramite la quantificazione della malondialdeide (MDA). I risultati mostrano che le vongole esposte a HWs e trapiantate con microbiota precedentemente sottoposto a Priming presentano un’attività maggiore di SOD e CAT rispetto al microbiota Controllo, per la GPx invece non si osservano differenze significative, ma si può comunque parlare di trend. Durante il periodo di studio sono state eseguite anche indagini a livello del molecolare. Nello specifico è stata effettuata un’analisi qPCR del gene 16S, in modo da evidenziare eventuali differenze o variazioni nell’abbondanza microbica relativa dei due gruppi e sequenziamento dell’amplicone dell’rRNA 16S per ottenere dati relativi alla diversità microbica (alpha diversity calcolata con l’indice Observed).