Preparation and characterization of dual payload nanobody-drug conjugates via chemical and enzymatic conjugation strategies

I nanobodies sono frammenti anticorpali a singolo dominio derivati dagli anticorpi a sole catene pesanti dei camelidi. Con un peso di 12–15 kDa, sono circa un decimo delle immunoglobuline convenzionali, ma conservano piena affinità per l’antigene. La loro struttura ridotta conferisce elevata stabilità, solubilità, specificità e bassa immunogenicità. La CDR3 allungata permette il riconoscimento di epitopi difficilmente accessibili agli anticorpi tradizionali. Possono essere prodotti facilmente in sistemi microbici e risultano versatili per applicazioni terapeutiche grazie alla buona penetrazione tissutale, alla distribuzione omogenea nei tumori solidi e alla facile ingegnerizzabilità. Una direzione promettente è lo sviluppo dei nanobody-drug conjugates (NDCs), ottenuti legando un nanobody a un farmaco citotossico. Rispetto agli ADCs, gli NDCs mostrano migliore penetrazione tumorale, eliminazione più rapida e ridotta tossicità off-target, con un accumulo più efficiente nei siti patologici. L’obiettivo della tesi è la generazione di NDCs a doppio payload mediante coniugazione chimica ed enzimatica. Nel percorso chimico è stato utilizzato MMAE, legato tramite uno spacer valina-citrullina con gruppo maleimmide e sito sensibile alle proteasi per il rilascio intracellulare. Nell’approccio enzimatico è stata impiegata la transglutaminasi microbica per coniugare Exatecan, collegato tramite uno spacer valina-alanina scindibile e dotato di una breve catena PEG per aumentarne la solubilità. La combinazione delle due strategie non ha ancora portato alla produzione di un NDC a doppio payload, ma ha permesso di identificare potenzialità, limiti e condizioni operative necessarie per rendere questo approccio realizzabile.