Indagine di un sistema proteina-peptide, Calmodulina-M13, attraverso Spettroscopia Dipolare Impulsata e Foto-indotta combinata a Dinamica Molecolare

La possibilità di combinare la procedura biochimica Site-Directed Spin Labeling su modelli proteici insieme alla spettroscopia impulsata dipolare EPR (Pulsed Dipolar Spectroscopy, PDS) ha consentito importanti sviluppi e ampio campo di indagine in ambito biologico-strutturale. La tecnica PDS svolge infatti un ruolo considerevole per lo studio di sistemi macromolecolari coprendo un intervallo di misura nell’ordine dei nanometri per quanto concerne distanze e relative distribuzioni. Questa tecnica, infatti, permette di ottenere informazioni partendo da interazioni dipolari tra coppie di sonde paramagnetiche, interpretabili come distribuzioni di distanze inter-sonda, nonché a garantire uno studio sull’efficienza della sonda stessa e della perturbazione che essa apporta al sistema. Sfruttando tecniche LiPDS (Light-induced PDS), oltre alle convenzionali sonde paramagnetiche, quali i nitrossidi, è possibile indagare sonde che evolvono a stato di tripletto attraverso foteccitazione, come le porfirine: queste molecole fotoeccitate, a seguito di Inter-System Crossing (ISC), presentano un meccanismo di polarizzazione di tipo non-Boltzmann contribuendo a migliorare la sensibilità di rilevazione strumentale. L'impiego altresì di metodi computazionali quale la Dinamica Molecolare (Molecular Dynamics, MD) consentono di affiancare il dato sperimentale PDS offrendo un supporto di previsione, nonché di conferma, descrivendo aspetti caratteristici quali mobilità, flessibilità e variazioni conformazionali del sistema in esame, non riscontrabili dal solo dato sperimentale PSD. L’indagine svolta nel presente lavoro di tesi è sul sistema modello costituito dal complesso proteina-peptide costituito dalla Calmodulina (CALcium MODUlated proteIN, CaM) e dal peptide bersaglio M13 rispettivamente marcati con specifiche sonde nitrossido (spirocyclohexil, SPIRO) e tetrafenil porfirina (5,10,15,20-tetraphenylporphyrin, TPP). A questo proposito, il sistema CaM-M13, in presenza di ioni calcio, è stato scelto poiché presenta una dinamica nonché funzione già note e pertanto può fungere come punto di partenza di indagine. In questo progetto di tesi è stato utilizzato l’approccio integrato LiPDS-MD e PDS-MD per indagare tre sistemi specifici: a singolo mutante in presenza di TPP, a doppio mutante in assenza e in presenza di TPP. Nello specifico, nel primo caso la traccia dipolare ottenuta con rispettive distribuzioni di distanza si riferisce alla distanza inter-sonda SPIRO-tripletto TPP (singolo mutante) dove entrambe le sonde risultano paramagnetiche; nel secondo e nel terzo caso, il contributo dipolare fa riferimento alla distanza inter-sonda SPIRO-SPIRO (doppio mutante) in assenza o in presenza di TPP che risulta, qualora presente, diamagnetica. L’obiettivo finale di questo progetto è quello di indagare la validità dell’approccio utilizzato e delle sonde impiegate, analizzando e confrontando i risultati ottenuti attraverso la MD con i dati PDS ed evidenziando caratteristiche quali perturbazione apportata al sistema, ingombro sterico, mobilità, flessibilità e variazioni conformazionali delle sonde stesse. Gli esperimenti Li-PDS e PDS proposti sono stati condotti dal gruppo di ricerca EPR del Dipartimento di Scienze Chimiche di Padova in collaborazione con il gruppo EPR dell’Università di Manchester.