Ciclofilina D e suoi mutanti: clonaggio, produzione e studio delle interazioni con OSCP e molecole di interesse farmacologico, mediante NMR e native MS

La ciclofilina D (CypD) è una peptidil prolil cis-trans isomerasi ed è un enzima coinvolto nella regolazione dell’apertura del poro di transizione mitocondriale (mPTP), un canale della membrana mitocondriale interna. Una sua apertura prolungata è associata a morte cellulare e a diverse malattie neurodegenerative. Viceversa, vi sono evidenze che un’inibizione di tale apertura sia alla base di diverse forme di tumore. Il primo obiettivo di questa tesi è stata l’espressione e la purificazione di CypD wild type (WT), per analizzare le possibili interazioni con piccole molecole mediante spettroscopia NMR bidimensionale e spettrometria di massa nativa, così da eventualmente individuare inibitori capaci di limitare l’apertura di mPTP. Sempre in questo contesto è stato condotto uno screening NMR di mini-frammenti per ricercare delle interazioni con i residui poco conservati tra le ciclofiline, date le difficoltà nel trovare ligandi selettivi per questo target. Il secondo obiettivo ha riguardato la produzione di alcuni mutanti di CypD e OSCP (oligomycin sensitivity conferral protein), una subunità di F1F0-ATP sintasi che sembra anch’essa essere correlata alla regolazione del mPTP. I mutanti espressi hanno lo scopo di mimare le modifiche post traduzionali di acetilazione e fosforilazione che in cellula sembrano favorire l’interazione tra CypD e OSCP, e quindi l’apertura prolungata di mPTP. Questa interazione è stata investigata tramite spettrometria di massa nativa. I risultati di questo lavoro hanno lo scopo di aprire nuove prospettive per l’individuazione di inibitori selettivi della CypD e di chiarire a livello molecolare i meccanismi di interazione tra CypD e OSCP.