La piocianina come redox cycler e bypass respiratorio: effetti sul fenotipo mitocondriale di NPCs derivati da paziente affetto da atassia di Friedreich (FRDA)

Friedreich’s ataxia (FRDA) is an autosomal recessive neurodegenerative disease caused by mutations in the FXN gene. In 96% of cases, there is a homozygous expansion of the GAA trinucleotide repeat in the first intron of FXN, which reduces the production of frataxin, a mitochondrial protein involved in the biogenesis of iron–sulfur (Fe–S) clusters. Fe–S clusters are small metal cofactors, which are important for electron transfer in the respiratory chain, through complexes I, II, and III. When frataxin levels are low, mitochondrial respiration is impaired and oxidative stress increases. Pyocyanin, derived from Pseudomonas aeruginosa, is a molecule with redox-cycling properties that has recently been proposed as a candidate able to bypass the impaired respiratory complexes, in particularly complexes I and III. This thesis started with an initial characterization of the mitochondrial phenotype of NPCs derived from stem cells of an FRDA patient and a healthy control. Subsequently, the effects of pyocyanin in NPCs were tested using cell viability assays, to identify a non-toxic concentration range of this molecule; transmission electron microscopy, to evaluate mitochondrial ultrastructure; fluorescence microscopy, to analyze mitochondrial membrane potential and cellular respiration assays using Seahorse technology. The results showed that pyocyanin treatment improved mitochondrial ultrastructure and respiration in FRDA NPCs, providing an initial proof of principle for a possible new therapeutic perspective.

L’atassia di Friedreich (FRDA) è una malattia neurodegenerativa autosomica recessiva causata da mutazioni del gene FXN. Nel 96% dei casi si ha espansione della tripletta GAA in omozigosi nel primo introne di FXN che causa riduzione dell’espressione di fratassina, una proteina mitocondriale coinvolta nella biogenesi dei centri ferro-zolfo. I centri Fe-S sono piccoli metallocofattori e presentano numerose funzioni, ma quella più nota è sicuramente il trasferimento di elettroni all’interno della catena respiratoria, attraverso i complessi I, II e III. La carenza di fratassina compromette dunque la respirazione mitocondriale e favorisce una condizione di stress ossidativo. La piocianina, derivata da Pseudomonas aeruginosa, è una molecola con caratteristiche di redox cycler che è stata recentemente proposta come candidato capace di bypassare complessi respiratori alterati, in particolare i complessi I e III, sia in vitro che in vivo, in alcuni modelli di malattie mitocondriali. Il presente lavoro di tesi è partito con una iniziale caratterizzazione del fenotipo mitocondriale di cellule NPCs (Neural Progenitor Cells), derivate da cellule staminali di un paziente FRDA e di un controllo sano. Successivamente, sono stati analizzati gli effetti della piocianina in NPCs mediante: i) saggi di vitalità cellulare, per individuare un range di concentrazioni non tossiche di questa molecola; ii) microscopia elettronica a trasmissione, per la valutazione dell’ultrastruttura mitocondriale; iii) microscopia a fluorescenza, per l’analisi del potenziale di membrana mitocondriale; iv) saggi di respirazione cellulare mediante Seahorse. I risultati ottenuti hanno consentito di evidenziare in vitro un miglioramento dell’ultrastruttura e della respirazione mitocondriale in NCPs FRDA trattate con piocianina e di fornire una prima proof-of-principle per una possibile nuova prospettiva terapeutica.