Phylogenetic and transcriptomic analysis of two putative STAT genes in the colonial ascidian Botryllus schlosseri.

The JAK/STAT pathway is an evolutionary conserved signalling pathway triggered by diverse cytokines, interferons, grow factors and related molecules. This pathway represents a remarkably straightforward mechanism whereby extracellular factors control gene expression. Seven STAT family members have been identified in mammals, while most of non-chordate invertebrates have one or two STAT genes. In so far analysed tunicates, which are the chordates considered the sister group of vertebrates, two STAT proteins have been found, but their functions have not been elucidated yet. In this study, we aimed to identify in B. schlosseri the putative STAT transcripts, characterise them, infer their phylogeny within chordates, and evaluate their expression in different experimental conditions. We have identified two putative different STAT transcripts in the transcriptome of the colonial tunicate Botryllus schlosseri. These transcripts, found in silico, were verified via PCR and Sanger sequencing, and their translation produced two proteins named STAT1 and STAT2. Once we obtained the full sequences of these transcripts, we performed a Maximum Likelihood phylogenetic analysis to investigate the homology relationship between the STAT genes in chordates. The analyses indicate that a duplication from a unique STAT gene happened in the chordate ancestor, resulting in the two extant STATs possessed by living tunicates and cephalochordates. In vertebrates, one of the two STATs inherited from the chordate ancestor results orthologous to STAT5A and STAT5B, the other inherited STAT is orthologous to the other vertebrate STAT genes. The expression of B. schlosseri STAT genes was measured throughout the colonial asexual cycle in the whole colony and in haemocytes, showing that their expression is dynamic throughout the blastogenetic cycle and distinct between the two genes. As reported in literature, the JAK/STAT pathway is triggered by several interleukins in mammals, such as the interleukin 17, which is upregulated in the solitary ascidian Ciona intestinalis through lipopolysaccharide (LPS) stimulation. We hypothesized the potential activation of the JAK/STAT pathway via LPS stimulation in B. schlosseri and we verified it throughout quantitative reverse transcription PCR. We found an upregulation of the STAT1 and Myc, an important gene involved in stemness, which has been proved to be target of STATs in mammals. Moreover, we demonstrated that the enhancement effect of the LPS stimulation for STAT1 and Myc is mediated by JAK through the combined treatments with the LPS and AG490, a JAK2 inhibitor. In conclusion, we demonstrated in B. schlosseri the existence and the activation of the JAK/STAT signalling in different experimental conditions. The results suggest that this pathway plays a role in the innate immune responses and stemness of this colonial chordate.

La via JAK/STAT è un meccanismo di segnalazione evolutivamente conservato ed è attivato da diverse citochine, interferoni, fattori di crescita e molecole correlate. Questa via rappresenta uno straordinario meccanismo dove fattori extracellulari controllano l’espressione genica. Nei mammiferi, sette membri della famiglia proteica degli STAT sono stati identificati, mentre negli invertebrati non cordati risultano uno o due geni STAT. Per quanto analizzato finora nei tunicati, che attualmente sono considerati il sister-group dei vertebrati, sono stati identificati due geni STAT ma la loro funzione non è stata ancora approfondita. Lo scopo di questo studio è stato quello di identificare dei trascritti STAT putativi, di caratterizzarli, di analizzare la loro relazione filogenetica con i cordati, e di valutare la loro espressione in differenti condizioni sperimentali. Abbiamo identificato due diversi trascritti STAT putativi nel trascrittoma del tunicato coloniale Botryllus schlosseri. Questi trascritti, identificati in silico, sono stati verificati sperimentalmente attraverso la PCR e il sequenziamento Sanger, e la loro traduzione produce due proteine chiamate STAT1 e STAT2. Una volta ottenute le sequenze complete di questi trascritti, abbiamo condotto un’analisi filogenetica di Maximum Likelihood per indagare la relazione di omologia tra i geni STAT nei cordati. Questa analisi indica che una duplicazione è avvenuta da un unico gene STAT nell’antenato comune dei cordati, che ha comportato alla generazione dei due geni STAT presenti negli attuali tunicati e cefalocordati. Nei vertebrati, uno dei due geni STAT ereditato dal cordato ancestrale è ortologo a STAT5A e STAT5B, mentre l’altro gene STAT ereditato è ortologo a tutti gli altri geni STAT. L’espressione dei geni STAT in B. schlosseri è stata misurata durante il ciclo blastogenetico nella colonia intera e negli emociti, mostrano un’espressione dinamica e differenziale tra questi due geni. Come riportato in letteratura, la via JAK/STAT è innescata da diverse interleuchine nei mammiferi, come per esempio l’interleuchina 17, che, nell’ascidia coloniale Ciona intestinalis, risulta essere indotta dalla stimolazione con lipopolisaccaride (LPS). In B. schlosseri, abbiamo ipotizzato una potenziale attivazione della via JAK/STAT attraverso la stimolazione con LPS e l’abbiamo verificata mediante la PCR quantitativa in tempo reale. Abbiamo osservato un’induzione dei geni STAT1 e Myc, un importante gene coinvolto nella staminalità che è stato riportato come target di STAT nei mammiferi. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’induzione dovuta dalla stimolazione da LPS per STAT1 e Myc è mediato da JAK attraverso il trattamento combinato con LPS e AG490, un inibitore di JAK2. In conclusione, in B. schlosseri abbiamo dimostrato l’esistenza e l’attivazione della via di segnalazione JAK/STAT in diverse condizioni sperimentali. Questi risultati suggeriscono un ruolo nella risposta immunitario e nella staminalità da parte di questa via in questo cordato coloniale.