Characterization and in-vitro evaluation of Vismodegib-loaded anti PD-L1 immunoliposome for skin cancer

Skin cancers are among the most prevalent tumors worldwide, arising from a combination of genetic and environmental factors, including aging and chronic sun exposure. Non-melanoma skin cancers (NMSCs) are the most frequent type and comprise keratinocyte-derived malignancies such as basal cell carcinoma and squamous cell carcinoma. Although typically less aggressive than melanoma skin cancer (MSC), where melanocyte mutations drive disease progression, NMSCs are more frequent and can still progress to metastatic and life-threatening forms, posing a significant clinical challenge. Depending on tumor stage and classification, different first- and second-line therapies are employed, many of which are aggressive or poorly tolerated by patients. Furthermore, these tumors often acquire resistance to chemotherapy, targeted therapies, and immune checkpoint blockade, leading to high rates of recurrence. These tumors frequently overexpress programmed cell death ligand 1 (PD-L1) and display constitutive aberrant activation of the Hedgehog (Hh) signaling pathway, both of which represent attractive therapeutic targets. Although anti-PD-L1 immunotherapies and Hh pathway inhibitors are available, they are typically used separately. Current clinical strategies increasingly explore combination approaches to overcome therapeutic resistance. In this context, the present project proposes the development of immunoliposomes loaded with vismodegib (VISMO), a selective Hh inhibitor, and functionalized with the Fab' fragment of atezolizumab, an anti-PD-L1 antibody. This dual-targeted system is designed to achieve more specific drug delivery to tumor cells while reducing the systemic side effects of free VISMO. Additionally, the Fab' fragment is expected not only to improve tumor cell targeting but also to enhance the immune response through PD-L1 blockade. The immunoliposomes obtained were physicochemically characterized using dynamic light scattering, zeta potential measurements, transmission electron microscopy, RP-HPLC, SDS-PAGE, bicinchoninic acid assay, and confocal laser scanning microscopy. These analyses confirmed their suitability as a delivery system. Moreover, the purification step was optimized using size-exclusion chromatography spin columns. Cytotoxicity was evaluated in two cell lines, HaCaT (human keratinocytes) and SK-Mel-28 (human melanoma), employing two assays: crystal violet staining and the ATPlite luminescence assay. The results demonstrated that, in tumor cells, the immunoliposomes exhibited greater efficacy compared both to the free drug and to the non-targeted formulation. In summary, an optimal formulation for delivering VISMO into PD-L1-targeted liposomes was successfully developed and characterized, and its in vitro evaluation suggested potential as a treatment for skin cancer, providing the basis for further preclinical studies.

I tumori della pelle rappresentano tra le neoplasie più diffuse a livello mondiale. I tumori cutanei non melanocitari (NMSCs) sono i più frequenti e comprendono neoplasie derivate dai cheratinociti, come il carcinoma basocellulare e il carcinoma squamocellulare. Il melanoma cutaneo (MSC), in cui le mutazioni dei melanociti guidano la progressione della malattia, è meno comune, ma i NMSCs, pur essendo più frequenti, possono comunque evolvere in forme metastatiche e potenzialmente letali, costituendo una sfida clinica significativa. A seconda dello stadio e della classificazione del tumore, vengono utilizzate diverse terapie di prima e seconda linea, molte delle quali risultano aggressive o poco tollerate dai pazienti. Inoltre, questi tumori sviluppano spesso resistenza alla chemioterapia, alle terapie mirate e al blocco dei checkpoint immunitari, con conseguenti alti tassi di recidiva. Questi tumori esprimono frequentemente in maniera eccessiva la proteina PD-L1 (programmed cell death ligand 1) e presentano una costitutiva e aberrante attivazione della via di segnalazione Hedgehog (Hh), entrambe considerate bersagli terapeutici promettenti. Sebbene siano disponibili immunoterapie anti-PD-L1 e inibitori della via Hh, queste vengono generalmente impiegate separatamente. Le strategie cliniche più recenti stanno invece esplorando approcci combinati per superare la resistenza terapeutica. In questo contesto, il presente progetto propone lo sviluppo di immunoliposomi caricati con vismodegib, un inibitore selettivo della via Hh, e funzionalizzati con il frammento Fab' di atezolizumab, un anticorpo anti-PD-L1. Questo sistema a doppio bersaglio è stato concepito per garantire un rilascio più specifico del farmaco alle cellule tumorali, riducendo al contempo gli effetti collaterali sistemici del vismodegib libero. Inoltre, il frammento Fab' non solo dovrebbe migliorare il targeting delle cellule tumorali, ma anche potenziare la risposta immunitaria attraverso il blocco di PD-L1. Gli immunoliposomi ottenuti sono stati caratterizzati dal punto di vista fisico-chimico mediante diffusione dinamica della luce, misurazioni del potenziale zeta, microscopia elettronica a trasmissione, RP-HPLC, SDS-PAGE, saggio BCA e microscopia confocale a scansione laser. Queste analisi hanno confermato l’idoneità della formulazione come sistema di rilascio. Inoltre, la fase di purificazione è stata ottimizzata utilizzando colonne a esclusione dimensionale (spin columns). La citotossicità è stata valutata su due linee cellulari, HaCaT (cheratinociti umani) e SK-Mel-28 (melanoma umano), attraverso due saggi: colorazione con violetto di cristallo e saggio luminescente ATPlite. I risultati hanno dimostrato che, nelle cellule tumorali, gli immunoliposomi hanno mostrato una maggiore efficacia sia rispetto al farmaco libero sia rispetto alla formulazione non mirata. In sintesi, è stata sviluppata e caratterizzata con successo una formulazione ottimale per il rilascio di vismodegib in liposomi mirati al PD-L1 e la sua valutazione in vitro ha suggerito un potenziale come trattamento per i tumori cutanei, ponendo le basi per ulteriori studi preclinici.