FORMULATION AND CHARACTERIZATION OF CONVENTIONAL AND TARGETED LIPID NANOPARTICLES FOR GENE DELIVERY

Gene therapy, which delivers nucleic acids to modulate gene expression, has emerged as a promising strategy for treating genetic disorders, including muscular dystrophies (MDs), a group of conditions characterized by progressive muscle degeneration, impaired mobility, and respiratory dysfunction. Targeting Nfix, a transcription factor regulating muscle regeneration, has been shown in previous studies that its silencing promotes oxidative muscle fibers and slows degeneration-regeneration cycles, thereby delaying disease progression. A plasmid encoding a short hairpin RNA (shRNA) against Nfix provides a selective and druggable approach to inhibit its expression. A key challenge in gene therapy is the safe and efficient delivery of nucleic acids to target cells. Lipid nanoparticles (LNPs) represent a promising non-viral delivery platform, offering high loading capacity, biocompatibility, and reduced immunogenicity. In this thesis, a series of LNP formulations were developed using a microfluidic mixing strategy that involved rapid combination of organic phase containing lipids with aqueous phase containing plasmid DNA. Formulations included either the cationic lipid DOTAP or the ionizable lipid Dlin-KC2-DMA as the primary complexing materials, while cholesterol and helper lipid (HSPC or DOPE) contributed to structural stabilization and membrane formation. PEG-2kDaDSPE was incorporated to create a hydrophilic corona capable of minimizing aggregation, reducing opsonization, and prolonging systemic circulation by limiting clearance via the reticuloendothelial system. To further enhance targeting of specific cell population, selected formulations were modified by replacing the PEG-2kDaDSPE with Mal-PEG-5kDaDSPE, enabling the conjugation of the A2G80 peptide. This peptide-functionalization strategy aimed to produce targeted LNPs with increased affinity for myogenic cells, promoting selective interaction, cellular uptake, while minimizing off-target effects. All formulations were characterized to evaluate their physicochemical properties and biological performance. Dynamic light scattering (DLS) was used to measure particle size, polydispersity index (PDI), and ζ-potential, while transmission electron microscopy (TEM) provided morphological visualization. Encapsulation efficiency was quantified using PicoGreen assay, and the integrity of the plasmid cargo was assessed by agarose gel electrophoresis. The functional activity was evaluated in myogenic cells by monitoring expression of the fluorescent reporters TdTomato or GFP, allowing direct assessment of transfection efficiency. To evaluate cytotoxicity, biodistribution and cardiac targeting of the lipid-nanoparticles labeled with Vybrant™ DiI Cell-Labeling Solution, in vivo studies were performed using transgenic zebrafish embryos expressing GFP in the myocardium, focusing on the performance of A2G80-functionalized LNPs.

La terapia genica, che prevede la somministrazione di acidi nucleici per modulare l’espressione genica, è emersa come una promettente strategia per il trattamento di malattie genetiche, comprese le distrofie muscolari (MDs), un gruppo di condizioni caratterizzate da degenerazione muscolare progressiva, ridotta mobilità e compromissione respiratoria. Il targeting di Nfix, un fattore di trascrizione che regola la rigenerazione muscolare, ha dimostrato in studi precedenti che il suo silenziamento favorisce fibre muscolari più ossidative e rallenta i cicli di degenerazione-rigenerazione, ritardando così la progressione della malattia. Un plasmide che codifica uno short hairpin RNA (shRNA) contro Nfix rappresenta un approccio selettivo e farmacologicamente applicabile per inibirne l’espressione. Una delle principali sfide nella terapia genica è la somministrazione sicura ed efficiente degli acidi nucleici alle cellule target. Le nanoparticelle lipidiche (LNPs) rappresentano una promettente piattaforma non virale per la somministrazione, offrendo elevata capacità di incapsulamento, biocompatibilità e ridotta immunogenicità. In questa tesi, sono state sviluppate diverse nanoparticelle lipidiche mediante una strategia di microfluidica che prevede la rapida combinazione di una fase organica contenente i lipidi e di una fase acquosa contenente il DNA plasmidico. Le formulazioni includono un lipide cationico DOTAP o un lipide ionizzabile Dlin-KC2-DMA come principali agenti complessanti, mentre colesterolo e lipidi helper (HSPC e DOPE) contribuiscono alla stabilizzazione strutturale e alla formazione della membrana. Il PEG-2kDaDSPE è stato incorporato per creare una corona idrofilica capace di minimizzare l’aggregazione, ridurre l’opsonizzazione e prolungare la circolazione sistemica limitando la clearance tramite il sistema reticoloendoteliale. Per migliorare ulteriormente il targeting verso specifiche popolazioni cellulari, alcune formulazioni sono state modificate sostituendo il PEG-2kDaDSPE con il Mal-PEG-5kDaDSPE, consentendo la coniugazione del peptide A2G80 sulla superfice delle nanoparticelle. Questa strategia di funzionalizzazione è finalizzata a sviluppare LNP direzionate con maggiore affinità per le cellule miogeniche, favorendo un’interazione più selettiva, un aumento dell’uptake cellulare, riducendo al contempo gli effetti off-target. Tutte le formulazioni sono state caratterizzare per valutarne le proprietà chimico-fisiche e le prestazioni biologiche. Dynamic light scattering (DLS) è stato impiegato per misurare la dimensione delle particelle, l’indice di polidispersione (PDI) e potenziale ζ, mentre la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è stata utilizzata per la valutazione morfologica. L’efficienza di incapsulamento è stata quantificata tramite il saggio PicoGreen e l’integrità del plasmide è stata osservata mediante elettroforesi su gel di agarosio. Infine, l’attività funzionale è stata valutata su cellule miogeniche monitorando l’espressione delle proteine reporter fluorescenti TdTomato o GFP, consentendo una misura diretta dell’efficienza di trasfezione. Per valutare la citotossicità, la biodistribuzione e il targeting cardiaco delle nanoparticelle lipidiche marcate con il Vybrant™ DiI Cell-Labeling Solution sono stati condotti studi in vivo utilizzando embrioni di zebrafish transgenici che esprimono GFP nel miocardio, concentrandosi sulle prestazioni delle LNP funzionalizzate con A2G80.