The oral delivery of biological drugs remains a major pharmaceutical challenge due to the extensive degradation of biomolecules within the gastrointestinal tract (GIT). To overcome these challenges, lipid nanoparticles (LNPs) have recently emerged as a promising platform to enhance the stability and absorption of therapeutic peptides. Herein, the influence of three phospholipids, EPC, DOPC and HSPC, on the biopharmaceutical performance of LNPs for oral administration of the exenatide, a GLP-1 analog for the treatment of Type II Diabetes Mellitus, was investigated. LNPs were produced using a microfluidic approach. Ethanol, as organic phase containing each phospholipid combined with cholesterol in a 1:3 molar ratio, and the aqueous phase, containing exenatide pre-complexed with the cationic lipid DOTAP at a 1:12 molar ratio according to hydrophobic ion-pairing (HIP) were mixed. The peptide feed was fixed at 10% (w/w) relative to the total lipid mass. The DOTAP/exenatide complex was efficiently incorporated into the lipid matrix, yielding high encapsulation efficiencies, around 95% and loading capacities, around 10%. Physical characterization via Dynamic Light Scattering (DLS) showed particle sizes of ~90 nm for LNP-EPC and LNP-DOPC and ~120 nm for LNP-HSPC, all with PDI values <0.2 and positive zeta potentials around +40 mV for LNP-EPC and LNP-DOPC and +50 mV for LNP-HSPC, confirming the incorporation of the cationic lipid DOTAP. Post-assembly surface modification with DSPE-PEG2kDa, with two degrees of PEGylation, (10% or 30% w/w) markedly reduced the zeta potential, to ~20 mV and <10 mV for both LNP-EPC and LNP-DOPC PEGylated with 10 and 30% DSPE-PEG2kDa, respectively, and ~15 mV and -3 mV for LNP-HSPC PEGylated with 10 and 30% DSPE-PEG2kDa, respectively. All formulations demonstrated good colloidal stability in the presence of lipase, simulated gastric fluid (SGF), and simulated intestinal fluid (SIF), which mimic the physiological gastrointestinal environment. Drug-release studies, conducted in SGF and SIF, revealed sustained release for up to 96 hours by the PEGylated LNP-EPC and LNP-DOPC, compared to complete release within 72 hours for the non-PEGylated counterparts. Non-PEGylated LNP-HSPC exhibited complete peptide release after 10 days, while PEGylated counterparts reached respectively 93% and 84% at the same time. Enzymatic stability assays, conducted for two hours in SGF with pepsin followed by incubation in SIF with trypsin for 6 hours, showed enhanced peptide protection by PEGylated LNPs, which retained ~65% of exenatide versus ~50% in non-PEGylated counterparts. Biocompatibility, assessed through MTT assays, indicated that all LNPs were biocompatible when incubated with Caco-2 and Caco-2/HT29-MTX co cultured to mimic the intestinal epithelium. Cellular association and permeability studies, performed with Caco-2/HT29-MTX co-culture model, demonstrated that increasing PEG surface density reduced nanoparticle interaction with cells. 10% PEGylation provided the best balance between mucus penetration and epithelial permeability, especially for LNP-DOPC, likely due to its flexible structure compared to LNP-HSPC. Confocal microscopy of co-culture models (Caco-2/HT29-MTX) incubated with all LNPs confirmed their interactions with cells.  

La somministrazione orale di farmaci biologici rappresenta una grande sfida farmaceutica a causa della vasta degradazione delle biomolecole all’interno del tratto gastrointestinale (GIT). Per superare queste sfide, le nanoparticelle lipidiche (LNP) sono recentemente emerse come una piattaforma promettente per migliorare la stabilità e l’assorbimento dei peptidi terapeutici. In questo studio, è stata indagata l’influenza di tre fosfolipidi, EPC, DOPC e HSPC, sulla performance biofarmaceutica delle LNP per la somministrazione orale di exenatide, un analogo del GLP-1 per il trattamento del Diabete Mellito di Tipo II. Le LNP sono state prodotte utilizzando un approccio microfluidico. La fase organica, contenente ciascun fosfolipide combinato con colesterolo in un rapporto molare 1:3, e la fase acquosa, contenente exenatide pre-complessato con il lipide cationico DOTAP in un rapporto molare 1:12 secondo l’accoppiamento ionico idrofobo (HIP), sono state miscelate. La concentrazione di peptide è stata fissata al 10% (p/p) rispetto alla massa totale di lipidi. Il complesso DOTAP/exenatide è stato efficacemente incorporato nella matrice lipidica, ottenendo alte efficienze di incapsulamento intorno al 95% e capacità di carico di circa 10%. La caratterizzazione fisica tramite Dynamic Light Scattering (DLS) ha mostrato dimensioni di particelle di ~90 nm per LNP-EPC e LNP-DOPC e ~120 nm per LNP-HSPC, tutte con valori di PDI <0.2 e potenziali zeta positivi intorno a +40 mV per LNP-EPC e LNP-DOPC e +50 mV per LNP-HSPC, confermando l’incorporazione del lipide cationico DOTAP. La modifica superficiale post-assemblaggio con DSPE-PEG2kDa, con due gradi di PEGilazione (10% o 30% p/p), ha ridotto notevolmente il potenziale zeta, a ~20 mV e <10 mV per LNP-EPC e LNP-DOPC PEGilate rispettivamente al 10% e 30% di DSPE-PEG2kDa, e a ~15 mV e -3 mV per LNP-HSPC PEGilate rispettivamente al 10% e 30%. Tutte le formulazioni hanno mostrato buona stabilità colloidale in presenza di lipasi, fluido gastrico simulato (SGF) e fluido intestinale simulato (SIF), che mimano l’ambiente fisiologico gastrointestinale. Gli studi di rilascio del farmaco, condotti in SGF e SIF, hanno rivelato un rilascio sostenuto fino a 96 ore per LNP-EPC e LNP-DOPC PEGilate, rispetto al rilascio completo entro 72 ore per le controparti non PEGilate. LNP-HSPC non PEGilate hanno mostrato un rilascio completo del peptide dopo 10 giorni, mentre le controparti PEGilate hanno raggiunto rispettivamente il 93% e l’84% allo stesso tempo. I saggi di stabilità enzimatica, condotti per due ore in SGF con pepsina seguite da incubazione in SIF con tripsina per 6 ore, hanno mostrato una protezione maggiore del peptide da parte delle LNP PEGilate, che hanno mantenuto ~65% di exenatide, rispetto al ~50% delle controparti non PEGilate. La biocompatibilità, valutata tramite saggi MTT, ha indicato che tutte le LNP erano biocompatibili quando incubate con co-colture di Caco-2 e Caco-2/HT29-MTX, per simulare l’epitelio intestinale. Gli studi di associazione cellulare e permeabilità, effettuati con il modello di co-coltura Caco-2/HT29-MTX, hanno dimostrato che l’aumento della densità superficiale di PEG riduceva l’interazione delle nanoparticelle con le cellule. La PEGilazione al 10% forniva il miglior equilibrio tra penetrazione nel muco e permeabilità epiteliale, in particolare per LNP-DOPC, probabilmente grazie alla sua struttura più flessibile rispetto a LNP-HSPC. La microscopia confocale dei modelli di co-coltura (Caco-2/HT29-MTX) incubati con tutte le LNP ha confermato le loro interazioni con le cellule.

Effect of different phospholipids on the biopharmaceutical profile of peptide-loaded LNPs for oral administration

NARDIS, VALERIA
2024/2025

Abstract

The oral delivery of biological drugs remains a major pharmaceutical challenge due to the extensive degradation of biomolecules within the gastrointestinal tract (GIT). To overcome these challenges, lipid nanoparticles (LNPs) have recently emerged as a promising platform to enhance the stability and absorption of therapeutic peptides. Herein, the influence of three phospholipids, EPC, DOPC and HSPC, on the biopharmaceutical performance of LNPs for oral administration of the exenatide, a GLP-1 analog for the treatment of Type II Diabetes Mellitus, was investigated. LNPs were produced using a microfluidic approach. Ethanol, as organic phase containing each phospholipid combined with cholesterol in a 1:3 molar ratio, and the aqueous phase, containing exenatide pre-complexed with the cationic lipid DOTAP at a 1:12 molar ratio according to hydrophobic ion-pairing (HIP) were mixed. The peptide feed was fixed at 10% (w/w) relative to the total lipid mass. The DOTAP/exenatide complex was efficiently incorporated into the lipid matrix, yielding high encapsulation efficiencies, around 95% and loading capacities, around 10%. Physical characterization via Dynamic Light Scattering (DLS) showed particle sizes of ~90 nm for LNP-EPC and LNP-DOPC and ~120 nm for LNP-HSPC, all with PDI values <0.2 and positive zeta potentials around +40 mV for LNP-EPC and LNP-DOPC and +50 mV for LNP-HSPC, confirming the incorporation of the cationic lipid DOTAP. Post-assembly surface modification with DSPE-PEG2kDa, with two degrees of PEGylation, (10% or 30% w/w) markedly reduced the zeta potential, to ~20 mV and <10 mV for both LNP-EPC and LNP-DOPC PEGylated with 10 and 30% DSPE-PEG2kDa, respectively, and ~15 mV and -3 mV for LNP-HSPC PEGylated with 10 and 30% DSPE-PEG2kDa, respectively. All formulations demonstrated good colloidal stability in the presence of lipase, simulated gastric fluid (SGF), and simulated intestinal fluid (SIF), which mimic the physiological gastrointestinal environment. Drug-release studies, conducted in SGF and SIF, revealed sustained release for up to 96 hours by the PEGylated LNP-EPC and LNP-DOPC, compared to complete release within 72 hours for the non-PEGylated counterparts. Non-PEGylated LNP-HSPC exhibited complete peptide release after 10 days, while PEGylated counterparts reached respectively 93% and 84% at the same time. Enzymatic stability assays, conducted for two hours in SGF with pepsin followed by incubation in SIF with trypsin for 6 hours, showed enhanced peptide protection by PEGylated LNPs, which retained ~65% of exenatide versus ~50% in non-PEGylated counterparts. Biocompatibility, assessed through MTT assays, indicated that all LNPs were biocompatible when incubated with Caco-2 and Caco-2/HT29-MTX co cultured to mimic the intestinal epithelium. Cellular association and permeability studies, performed with Caco-2/HT29-MTX co-culture model, demonstrated that increasing PEG surface density reduced nanoparticle interaction with cells. 10% PEGylation provided the best balance between mucus penetration and epithelial permeability, especially for LNP-DOPC, likely due to its flexible structure compared to LNP-HSPC. Confocal microscopy of co-culture models (Caco-2/HT29-MTX) incubated with all LNPs confirmed their interactions with cells.  
2024
Effect of different phospholipids on the biopharmaceutical profile of peptide-loaded LNPs for oral administration
La somministrazione orale di farmaci biologici rappresenta una grande sfida farmaceutica a causa della vasta degradazione delle biomolecole all’interno del tratto gastrointestinale (GIT). Per superare queste sfide, le nanoparticelle lipidiche (LNP) sono recentemente emerse come una piattaforma promettente per migliorare la stabilità e l’assorbimento dei peptidi terapeutici. In questo studio, è stata indagata l’influenza di tre fosfolipidi, EPC, DOPC e HSPC, sulla performance biofarmaceutica delle LNP per la somministrazione orale di exenatide, un analogo del GLP-1 per il trattamento del Diabete Mellito di Tipo II. Le LNP sono state prodotte utilizzando un approccio microfluidico. La fase organica, contenente ciascun fosfolipide combinato con colesterolo in un rapporto molare 1:3, e la fase acquosa, contenente exenatide pre-complessato con il lipide cationico DOTAP in un rapporto molare 1:12 secondo l’accoppiamento ionico idrofobo (HIP), sono state miscelate. La concentrazione di peptide è stata fissata al 10% (p/p) rispetto alla massa totale di lipidi. Il complesso DOTAP/exenatide è stato efficacemente incorporato nella matrice lipidica, ottenendo alte efficienze di incapsulamento intorno al 95% e capacità di carico di circa 10%. La caratterizzazione fisica tramite Dynamic Light Scattering (DLS) ha mostrato dimensioni di particelle di ~90 nm per LNP-EPC e LNP-DOPC e ~120 nm per LNP-HSPC, tutte con valori di PDI <0.2 e potenziali zeta positivi intorno a +40 mV per LNP-EPC e LNP-DOPC e +50 mV per LNP-HSPC, confermando l’incorporazione del lipide cationico DOTAP. La modifica superficiale post-assemblaggio con DSPE-PEG2kDa, con due gradi di PEGilazione (10% o 30% p/p), ha ridotto notevolmente il potenziale zeta, a ~20 mV e <10 mV per LNP-EPC e LNP-DOPC PEGilate rispettivamente al 10% e 30% di DSPE-PEG2kDa, e a ~15 mV e -3 mV per LNP-HSPC PEGilate rispettivamente al 10% e 30%. Tutte le formulazioni hanno mostrato buona stabilità colloidale in presenza di lipasi, fluido gastrico simulato (SGF) e fluido intestinale simulato (SIF), che mimano l’ambiente fisiologico gastrointestinale. Gli studi di rilascio del farmaco, condotti in SGF e SIF, hanno rivelato un rilascio sostenuto fino a 96 ore per LNP-EPC e LNP-DOPC PEGilate, rispetto al rilascio completo entro 72 ore per le controparti non PEGilate. LNP-HSPC non PEGilate hanno mostrato un rilascio completo del peptide dopo 10 giorni, mentre le controparti PEGilate hanno raggiunto rispettivamente il 93% e l’84% allo stesso tempo. I saggi di stabilità enzimatica, condotti per due ore in SGF con pepsina seguite da incubazione in SIF con tripsina per 6 ore, hanno mostrato una protezione maggiore del peptide da parte delle LNP PEGilate, che hanno mantenuto ~65% di exenatide, rispetto al ~50% delle controparti non PEGilate. La biocompatibilità, valutata tramite saggi MTT, ha indicato che tutte le LNP erano biocompatibili quando incubate con co-colture di Caco-2 e Caco-2/HT29-MTX, per simulare l’epitelio intestinale. Gli studi di associazione cellulare e permeabilità, effettuati con il modello di co-coltura Caco-2/HT29-MTX, hanno dimostrato che l’aumento della densità superficiale di PEG riduceva l’interazione delle nanoparticelle con le cellule. La PEGilazione al 10% forniva il miglior equilibrio tra penetrazione nel muco e permeabilità epiteliale, in particolare per LNP-DOPC, probabilmente grazie alla sua struttura più flessibile rispetto a LNP-HSPC. La microscopia confocale dei modelli di co-coltura (Caco-2/HT29-MTX) incubati con tutte le LNP ha confermato le loro interazioni con le cellule.
lipid nanoparticles
oral peptides
peptide formulation
microfluidics
diabetes
SALMASO, STEFANO
Lauree magistrali
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