Biocatalisi a cellula intera in Synechocystis sp. PCC 6803 per la sintesi di derivati fenolici.

Il presente lavoro di tesi si inserisce nell'ambito della biocatalisi a cellula intera, focalizzandosi sullo sviluppo di strategie biosintetiche nel cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803 per la produzione di derivati fenolici. Lo studio esplora in particolare l'impiego di due classi enzimatiche: la Baeyer-Villiger Monoossigenasi (BVMO) e l’UDP-glicosiltransferasi (UGT). Inizialmente, è stata testata una strategia basata sull'espressione di una proteina di fusione comprendente entrambi i domini catalitici, con l'obiettivo di co-localizzare le due reazioni. Tuttavia, le analisi condotte sui ceppi trasformanti non hanno evidenziato la produzione della molecola target. Tale esito è stato ipoteticamente attribuito a un ripiegamento tridimensionale (misfolding) non ottimale del dominio UGT all'interno del costrutto chimerico, tale da comprometterne l'attività biocatalitica. Per superare questa criticità, la ricerca si è orientata verso l'esplorazione di un nuovo enzima glicosiltransferasico (UGT), selezionato per le sue comprovate caratteristiche di elevata efficienza catalitica e stringente regioselettività. L'ingegnerizzazione di un nuovo ceppo esprimente questo enzima ha portato con successo alla sintesi in vivo del glucoside fenolico desiderato, validando l'efficacia del biocatalizzatore alternativo. Successivamente, l'attenzione si è spostata sulla caratterizzazione dell'attività del ceppo esprimente l'enzima BVMO. La sua attività è stata testata valutando diverse condizioni sperimentali, modulando parametri quali l'intensità luminosa e la concentrazione iniziale del substrato. I risultati hanno confermato la notevole versatilità dell'enzima, dimostrando la sua capacità di ossidare efficientemente anche substrati glicosilati (stericamente ingombranti) e di mantenere l'attività catalitica anche ad elevate concentrazioni, tollerando il potenziale stress cellulare. Infine, l'identità molecolare dei prodotti target ottenuti dalle diverse biotrasformazioni è stata rigorosamente validata mediante analisi qualitativa in spettrometria di massa (MS), confermando il successo complessivo delle strategie ingegneristiche adottate.