Analisi del profilo genetico delle cellule tumorali circolanti da biopsia liquida del tumore della mammella: confronto tra le tecnologie del Metabolism Based Assay e del DEPArray

Metastatic Breast Cancer (MBC) remains a leading cause of cancer mortality in women. Metastases can exhibit genomic profiles significantly different from the primary tumor, often making characterization based on a single tissue biopsy inadequate. Liquid biopsy represents a minimally invasive alternative for real-time monitoring of disease evolution through the analysis of circulating tumor cells (CTCs). The aim of this study was to compare an approach based on immunophenotypic markers (DEPArray™) and an approach based on cellular metabolism (DropH) for the isolation of CTCs from patients with metastatic breast cancer. In particular, we evaluated the impact of the two methods on cell viability, genomic integrity, and the quality of data obtained from single-cell genomic analyses. Prior to the analysis of clinical samples, all experimental protocols were optimized using “spiked-samples,” obtained by adding breast cancer cell lines to peripheral blood samples from healthy donors. These preliminary experiments were used for the validation and optimization of enrichment phases, single-cell isolation, whole genome amplification (WGA), quality control, and library preparation for sequencing. Subsequently, peripheral blood samples from patients were collected at the start of a new line of systemic therapy. After red blood cell lysis and immunomagnetic depletion of CD45+ leukocytes, samples were processed in parallel with the DEPArray™ system and the DropH platform. The recovered single cells were subjected to WGA and quality control by evaluating the Genome Integrity Index (GII). Based on the quality control results, eligible samples were analyzed by shallow Whole Genome Sequencing (sWGS) for the assessment of Copy Number Alterations (CNA) and by targeted sequencing of mutational hot-spots for the identification of single nucleotide variants (SNV) and small indels. Bioinformatic analyses were conducted using dedicated pipelines, and the genomic profiles of the CTCs were compared with those of the primary tumor through hierarchical clustering analysis. The DropH approach allowed for the recovery of a smaller number of cells compared to DEPArray™, but showed a significantly higher percentage of cells with a high degree of genomic integrity. CNA analysis by sWGS highlighted relatively balanced profiles with a limited number of alterations in most CTCs, while a subset of cells showed aberrant profiles compatible with a neoplastic origin. Targeted sequencing revealed numerous non-synonymous variants in genes involved in key tumorigenic processes. The comparison between CTCs and the primary tumor showed limited sharing of mutations, emphasizing marked molecular heterogeneity and suggesting clonal selection phenomena during disease progression and under therapeutic pressure. Hierarchical clustering analysis confirmed the presence of distinct subpopulations of CTCs with partially divergent mutational landscapes. This study demonstrates the feasibility of single-cell genomic characterization of CTCs in metastatic breast cancer and highlights substantial differences between a marker-based and a metabolism-based approach. In particular, the DropH method proved advantageous in terms of preserving genomic integrity and cell viability, offering a valid marker-independent alternative for the study of tumor heterogeneity.

Il carcinoma mammario metastatico (MBC) rimane una delle principali cause di mortalità oncologica nelle donne. Le metastasi possono presentare profili genomici significativamente differenti rispetto al tumore primitivo, rendendo spesso inadeguata una caratterizzazione basata su una singola biopsia tissutale. La biopsia liquida rappresenta un’alternativa minimamente invasiva per il monitoraggio in tempo reale dell'evoluzione della malattia attraverso l’analisi delle cellule tumorali circolanti (CTC). Lo scopo di questo studio è stato quello di confrontare un approccio basato su marcatori immunofenotipici (DEPArray™) e un approccio basato sul metabolismo cellulare (DropH) per l’isolamento di CTC da pazienti con carcinoma mammario metastatico. In particolare, abbiamo valutato l’impatto dei due metodi sulla vitalità cellulare, sull’integrità genomica e sulla qualità dei dati ottenuti dalle analisi genomiche single-cell. Prima dell’analisi dei campioni clinici, tutti i protocolli sperimentali sono stati ottimizzati utilizzando "spiked-samples", ottenuti aggiungendo linee cellulari di carcinoma mammario a campioni di sangue periferico di donatori sani. Questi esperimenti preliminari sono stati utilizzati per la validazione e l'ottimizzazione delle fasi di arricchimento, dell'isolamento single-cell, dell'amplificazione dell'intero genoma (WGA), del controllo di qualità e della preparazione delle librerie per il sequenziamento. Successivamente, i campioni di sangue periferico delle pazienti sono stati raccolti all'inizio di una nuova linea di terapia sistemica. Dopo la lisi dei globuli rossi e la deplezione immunomagnetica dei leucociti CD45+, i campioni sono stati processati in parallelo con il sistema DEPArray™ e la piattaforma DropH. Le singole cellule recuperate sono state sottoposte a WGA e al controllo di qualità mediante la valutazione del Genome Integrity Index (GII). Sulla base dei risultati del controllo di qualità, i campioni idonei sono stati analizzati mediante shallow Whole Genome Sequencing (sWGS) per la valutazione delle variazioni del numero di copie (CNA) e mediante sequenziamento mirato di hot-spot mutazionali per l’identificazione di varianti a singolo nucleotide (SNV) e piccole indel. Le analisi bioinformatiche sono state condotte utilizzando pipeline dedicate e i profili genomici delle CTC sono stati confrontati con quelli del tumore primitivo attraverso l'analisi di clustering gerarchico. L'approccio DropH ha consentito il recupero di un numero inferiore di cellule rispetto al DEPArray™, ma ha mostrato una percentuale significativamente più elevata di cellule con un alto grado di integrità genomica. L'analisi delle CNA mediante sWGS ha evidenziato profili relativamente bilanciati con un numero limitato di alterazioni nella maggior parte delle CTC, mentre un sottogruppo di cellule ha mostrato profili aberranti compatibili con un'origine neoplastica. Il sequenziamento mirato ha rivelato numerose varianti non sinonime in geni coinvolti in processi tumorigenici chiave. Il confronto tra le CTC e il tumore primitivo ha mostrato una condivisione limitata di mutazioni, sottolineando una marcata eterogeneità molecolare e suggerendo fenomeni di selezione clonale durante la progressione della malattia e sotto pressione terapeutica. L'analisi di clustering gerarchico ha confermato la presenza di distinte sottopopolazioni di CTC con paesaggi mutazionali parzialmente divergenti. Questo studio dimostra la fattibilità della caratterizzazione genomica single-cell delle CTC nel carcinoma mammario metastatico e mette in evidenza differenze sostanziali tra un approccio basato sui marcatori e uno basato sul metabolismo. In particolare, il metodo DropH si è dimostrato vantaggioso in termini di preservazione dell'integrità genomica e della vitalità cellulare, offrendo una valida alternativa marker-independent per lo studio dell'eterogeneità tumorale.