Design and Fabrication of Engineered Microwells for High-Throughput Culture and High-Resolution Imaging of Cellular Spheroids

Three-dimensional (3D) cell cultures are gaining an increasingly important role due to their ability to more accurately reproduce in vivo cellular behavior compared to traditional two-dimensional (2D) culture systems. In this context, scalable 3D culture systems such as microwells have become established for rapid and standardized production of a large number of cellular spheroids; however, commercially available devices still present significant limitations, particularly related to imaging. The aim of this thesis is the design and fabrication of microwells with tunable shapes and dimensions, compatible with high-throughput cell culture and high-resolution imaging techniques. To this end, several designs were compared and various technologies for the fabrication of the initial molds were evaluated, including 3D printing and two-photon fabrication, in order to identify the best compromise between production time, technological constraints, and the efficiency of the final outcome. Another crucial aspect concerns the materials used for microwell fabrication, which must ensure biocompatibility while enabling improved imaging performance. Special attention was also devoted to the material-cell interface to limit cell adhesion to the substrate by implementing and evaluating different surface functionalization strategies. The developed system enables the generation of numerous three-dimensional spheroids and the longitudinal characterization of their morphological and functional features. In addition, 3D bioprinting preliminary experiments were carried out using spheroids to assess the printability of spheroid-based bioinks. Since fabricated microwells enable the production of a high number of spheroids, this platform could be particularly suitable for the development of spheroid-based bioinks for 3D bioprinting applications.

Le colture cellulari tridimensionali (3D) stanno acquisendo un ruolo sempre più rilevante grazie alla capacità di riprodurre in modo più accurato il comportamento cellulare in vivo rispetto ai sistemi tradizionali di coltura bidimensionali (2D). In questo contesto, sistemi di coltura 3D scalabili come le microwell si sono affermati per la produzione rapida e standardizzata di un elevato numero di sferoidi cellulari; tuttavia, i dispositivi attualmente disponibili in commercio presentano limitazioni significative, in particolare legate all'imaging. L’obiettivo di questa tesi è la progettazione e la realizzazione di microwell modulabili in forma e dimensioni, compatibili con colture cellulari high-throughput e con tecniche di imaging ad alta risoluzione. A tal fine, sono stati analizzati diversi aspetti progettuali e produttivi. In particolare, sono stati confrontati differenti design e sono state valutate diverse tecnologie per la realizzazione degli stampi iniziali, tra cui la stampa 3D e la fabbricazione a due fotoni, ricercando il miglior compromesso tra tempi di produzione, limiti tecnologici ed efficienza del risultato finale. Un ulteriore aspetto cruciale riguarda i materiali impiegati per la realizzazione delle microwell, che devono garantire biocompatibilità e consentire un imaging ottimale. Particolare attenzione è stata inoltre dedicata all’interfaccia materiale/cellula per limitare l’adesione cellulare al substrato implementando e valutando diverse strategie di funzionalizzazione superficiale. Il sistema sviluppato consente la creazione di numerosi sferoidi tridimensionali e la caratterizzazione, nel tempo, delle loro caratteristiche morfologiche e funzionali. Inoltre, sono stati condotti esperimenti preliminari di biostampa 3D per valutare la stampabilità di bioink basati su sferoidi. Poiché le microwell fabbricate consentono la produzione di un elevato numero di sferoidi, questa piattaforma potrebbe essere particolarmente adatta allo sviluppo di bioink basati su sferoidi per applicazioni di biostampa 3D.