Analisi della risposta meccanobiologica dell’endotelio ad alto sforzo di taglio mediante un sistema microfluidico: adattamento morfologico e attivazione trascrizionale ateroprotettiva

Wall shear stress (WSS) regulates cellular responses that are fundamental to cardiovascular physiopathology. This thesis describes the development and characterization of an in vitro microfluidic system to study the mechanobiological response of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) to high WSS (4 Pa) compared to static control. The system employs a parallel-plate chamber made of polymethyl methacrylate (PMMA) with a functionalized cyclic olefin copolymer (COC) substrate, connected to a recirculating peristaltic pump. The stimulus was applied for 24 hours on independent replicates. The response was characterized by: (i) quantitative morphological analysis using immunofluorescence for β-catenin and segmentation with AIVIA, extracting the nematic order parameter ; (ii) confocal immunofluorescence for Golgi polarization (GM130), mechanotransduction (YAP), and mitochondrial morphology (TOMM20); (iii) RT-qPCR for eight genes (KLF2, KLF4, PTGS2, ICAM1, VCAM1, ALPL, DLL4, PDK4) normalized to GAPDH. HUVECs exposed to 4 Pa exhibited perpendicular alignment to flow ( between −0.51 and −0.86), increased aspect ratio, and reduced circularity. Qualitative β-catenin analysis suggests consolidation of intercellular junctions toward a linear and continuous pattern, although objective quantification via line-scan analysis remains a future development. The Golgi apparatus showed upstream depletion and downstream/lateral redistribution. YAP exhibited massive nuclear translocation (up to 93% of cells predominantly nuclear, with N/C ratio up to 2.12 ± 0.96), preceded by marked basal variability among static replicates, which was homogenized by mechanical stimulation. Mitochondria shifted toward a fragmented phenotype, indicative of fission activation to support the energetic demands of remodeling. RT-qPCR revealed overexpression of KLF2 (FC = 6.20, = 0.016), KLF4 (FC = 12.19, = 0.040), and ALPL (FC = 9.21, = 0.0098), with ICAM1 and VCAM1 remaining stable. This 24-hour profile, compared to 6-hour literature data, suggests complete structural adaptation with stabilization of inflammatory expression. Overall, the data delineate a phenotype of active quiescence: the endothelium responds to elevated hemodynamic stress by activating a coordinated mechanical resistance program — geometric reorientation, junctional consolidation, organelle reorganization, and atheroprotective gene expression — without triggering inflammatory distress signals. The developed system constitutes a flexible and multimodal experimental platform for studying endothelial mechanobiological adaptation, with potential applications in basic cardiovascular research and in vitro pharmacological assessment.

Il wall shear stress (WSS) regola risposte cellulari fondamentali per la fisiopatologia cardiovascolare. Questa tesi descrive lo sviluppo e la caratterizzazione di un sistema microfluidico in vitro per studiare la risposta meccanobiologica di cellule endoteliali umane della vena ombelicale (HUVEC) a WSS alto (4 Pa) in confronto al controllo statico. Il sistema impiega una camera a piatti paralleli in polimetilmetacrilato (PMMA) con substrato in Copolimero di Olefina Ciclica (COC) funzionalizzato, collegata a una pompa peristaltica in ricircolo. Lo stimolo viene applicato per 24h su replicati indipendenti. La risposta è stata caratterizzata mediante: (i) analisi morfologica quantitativa tramite immunofluorescenza per β-catenina e segmentazione con AIVIA, con estrazione del parametro d’ordine nematico ; (ii) immunofluorescenza confocale per polarizzazione (GM130), meccanotrasduzione (YAP) e morfologia mitocondriale (TOMM20); (iii) RT-qPCR per otto geni (KLF2, KLF4, PTGS2, ICAM1, VCAM1, ALPL, DLL4, PDK4) normalizzati su GAPDH. Le HUVEC esposte a 4 Pa mostrano orientamento perpendicolare al flusso ( compreso tra −0.51 e −0.86), aumento del rapporto d’aspetto e riduzione della circolarità. L’analisi qualitativa della β-catenina suggerisce un consolidamento delle giunzioni intercellulari verso un pattern lineare e continuo, sebbene la quantificazione oggettiva tramite line-scan analysis costituisca uno sviluppo futuro. Il Golgi mostra deplezione upstream e redistribuzione downstream/laterale. YAP rivela traslocazione nucleare massiccia (fino al 93% di cellule a prevalenza nucleare, con rapporto N/C fino a 2.12 ± 0.96), preceduta da una marcata variabilità basale tra replicati statici, uniformata dallo stimolo meccanico. I mitocondri transitano verso un fenotipo frammentato, indicativo di un’attivazione della fissione funzionale al supporto energetico del rimodellamento. RT-qPCR documenta sovraespressione di KLF2 (FC = 6.20, = 0.016), KLF4 (FC = 12.19, = 0.040) e ALPL (FC = 9.21, = 0.0098), con stabilità di ICAM1 e VCAM1. Tale profilo a 24 h, confrontato con letteratura a 6 h, suggerisce un adattamento strutturale completo con stabilizzazione dell’espressione infiammatoria. Complessivamente, i dati delineano un fenotipo di quiescenza attiva: l’endotelio risponde allo stress emodinamico elevato attivando un programma coordinato di resistenza meccanica — riorientamento geometrico, consolidamento giunzionale, riorganizzazione degli organelli e firma genica ateroprotettiva — senza innescare segnali di sofferenza infiammatoria. Il sistema sviluppato costituisce una piattaforma sperimentale flessibile e multimodale per lo studio dell’adattamento meccanobiologico endoteliale, con prospettive di applicazione nella ricerca cardiovascolare di base e nella valutazione farmacologica in vitro.