Studio della morfogenesi di epitali mammari in matrici extracellulari definite

The extracellular matrix (ECM) plays a fundamental role in the organization of epithelial tissues, providing structural support as well as biochemical and mechanical cues that regulate cell polarity, differentiation and morphogenesis. Specifically, the composition and organization of the basement membrane, a specialized structure of the ECM, are crucial for the formation of organoids of mammary tissue. Three-dimensional (3D) in vitro culture systems, such as spheroids and organoids, represent valuable tools for studying epithelial morphogenesis under controlled conditions, as they more closely recapitulate tissue architecture and cell-cell and cell-matrix interactions compared to two-dimensional cultures. Currently, most 3D epithelial models rely on Matrigel, an animal-derived basement membrane extract. However, its complex and poorly defined composition, together with batch-to-batch variability, hinders a detailed understanding of the role of individual ECM components in regulating epithelial organization and dynamics. These limitations highlight the need for defined matrix systems that enable more controlled investigation of cell-matrix interactions. The aim of this thesis was to investigate how individual ECM components contribute to the growth, structural organization and dynamic behavior of mammary epithelial organoids. To this end, defined matrix systems were engineered by selectively incorporating key ECM components, with Matrigel used as a as control condition. The non-tumorigenic human mammary epithelial cell line MCF-10A was used as the cellular model, and organoids were generated using a suspension-based culture method across the different matrix conditions investigated. Organoid growth and morphology were first monitored at defined timepoints using bright-field microscopy. Time-lapse image sequences were then acquired under controlled culture conditions using a microscopy system equipped with an integrated incubator. This approach enabled continuous tracking of organoid morphological changes over time across the different experimental conditions. Time-lapse sequences were then subjected to quantitative image analysis to extract morphological descriptors of organoid growth, as well as dynamic parameters associated with the structural organization of the surrounding matrix. Particular attention was given to the directionality and velocity of the movement of traceable components within the extracellular microenvironment. Following this temporal characterization, immunofluorescence was employed to investigate the three-dimensional organization of the organoid–ECM system. Confocal fluorescence microscopy provided detailed images for the analysis of the spatial laminin distribution, the key protein of the basement membrane and major component of Matrigel. The results demonstrated that ECM composition and organization significantly influence multiple aspects of mammary epithelial organoid growth and structural development. Different matrix conditions led to variations in growth kinetics, morphological regularity and spatial organization of laminin. Furthermore, temporal dynamic analyses revealed differences in collective rotational motion and in the displacement patterns of surrounding matrix particles, highlighting a close relationship between epithelial morphogenesis and mechanical interactions with the ECM. Additionally, an automated image analysis pipeline was implemented partially automate key steps of the proposed workflow. Overall, this project demonstrates the unprecedent engineering of compositionally and architecturally defined ECM systems, allowing to elucidate how matrix properties regulate both structural and dynamic aspects of epithelial organization, thereby advancing the development of more controlled and physiologically relevant 3D models.

La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo fondamentale nell’organizzazione dei tessuti epiteliali, fornendo supporto strutturale e segnali biochimici e meccanici che regolano polarità cellulare, differenziamento e morfogenesi. In particolare, la composizione e l’organizzazione della membrana basale, struttura specializzata dell’ECM, sono determinanti per la formazione di organoidi del tessuto mammario. I sistemi di coltura tridimensionali (3D) in vitro, come sferoidi e organoidi, rappresentano strumenti importanti per studiare la morfogenesi epiteliale in condizioni controllate, poiché riproducono più fedelmente l’architettura tissutale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice rispetto alle colture bidimensionali. Ad oggi, i modelli epiteliali 3D utilizzano principalmente Matrigel, un estratto di membrana basale di origine animale. Tuttavia, la sua composizione complessa e indefinita, unita alla variabilità tra lotti, limita una comprensione dettagliata del ruolo dei singoli componenti dell'ECM nella regolazione dell’organizzazione e della dinamica epiteliale. Queste criticità evidenziano la necessità di matrici definite che consentano di studiare in modo specifico le interazioni cellula-matrice. L’obiettivo di questa tesi è stato di investigare come le singole componenti dell’ECM contribuiscano alla crescita, all’organizzazione strutturale e al comportamento dinamico di organoidi epiteliali mammari. A tal fine, sono state ingegnerizzate matrici in cui elementi chiave dell’ECM sono stati introdotti in modo controllato, mentre il Matrigel è stato usato come controllo. Come modello cellulare è stata utilizzata la linea epiteliale mammaria umana non tumorigenica MCF-10A, coltivata in sospensione nelle diverse condizioni sperimentali. Crescita e morfologia degli organoidi sono state inizialmente monitorate a tempi definiti mediante microscopia ottica. Successivamente, sono state acquisite sequenze time-lapse in condizioni di coltura controllate tramite un sistema di microscopia dotato di incubatore integrato. Le sequenze time-lapse sono state quindi sottoposte ad analisi quantitativa, per estrarre parametri morfologici legati alla crescita degli organoidi, e parametri dinamici relativi all’organizzazione strutturale della matrice. Particolare attenzione è stata dedicata a direzionalità e velocità dei componenti tracciabili del microambiente extracellulare. Dopo aver caratterizzato l’evoluzione temporale degli organoidi in diverse matrici, è stata utilizzata l'immunofluorescenza per comprendere l’organizzazione tridimensionale delle componenti del sistema organoide-ECM. La microscopia confocale a fluorescenza ha fornito immagini dettagliate per l'analisi della distribuzione spaziale della laminina, proteina chiave della membrana basale e principale costituente del Matrigel. I risultati hanno dimostrato che composizione e organizzazione dell’ECM influenzano in modo significativo la crescita e strutturazione degli organoidi epiteliali mammari. Le diverse condizioni di matrice hanno portato a variazioni nella cinetica di crescita, nella regolarità morfologica e nell’organizzazione spaziale della laminina. Inoltre, le analisi dinamiche hanno evidenziato differenze nel moto rotazionale collettivo e nei pattern di spostamento delle particelle della matrice circostante, evidenziando una stretta relazione tra morfogenesi epiteliale e interazioni meccaniche con l’ECM. Infine, è stata implementata una pipeline automatizzata di analisi delle immagini con l’obiettivo di automatizzare le principali fasi delle analisi svolte. Nel complesso, questo progetto dimostra l’ingegnerizzazione senza precedenti di sistemi di ECM a composizione e architettura definiti che hanno consentito di chiarire come la composizione della matrice regoli sia aspetti strutturali che dinamici dell’organizzazione epiteliale, contribuendo allo sviluppo di modelli 3D più controllati.