Whole Exome Sequencing e Reverse Phenotyping – Studi funzionali di varianti del gene ASL su S. cerevisiae

Whole Exome Sequencing (WES) is currently the diagnostic tool of choice for complex, atypical, or multisystemic genetic diseases in which conventional methods have failed to identify a cause. By massively parallel sequencing of all human coding regions (~20,000 genes, ~60 Mb), WES provides systematic, hypothesis-independent exome analysis. A 2025 meta-analysis (Kim et al., Systematic Reviews) documented a diagnostic yield of 34.2% in epilepsy and 35.3% in neurodevelopmental disorders, significantly higher than targeted gene panels (23.2%) and chromosomal microarray analysis (13.3%). WES achieves its greatest diagnostic impact when integrated with Reverse Phenotyping (RP), defined as the systematic reassessment of the patient's clinical features in light of genetic findings (Jezdik et al., Genes 2024). Whenever WES reveals variants in genes not anticipated by the initial clinical hypothesis, RP is required to translate the molecular finding into concrete clinical diagnosis, targeted biochemical investigations, and access to specific therapies. The need for RP is significantly greater in patients with negative results from prior genetic testing, the most diagnostically challenging cases. This work consists of two main components. The first describes WES technology, including the Twist Bioscience library preparation methodology and its technical specificities, variant interpretation per ACMG/AMP guidelines, and the Reverse Phenotyping paradigm applied to complex cases of unknown genetic etiology. The second focuses on the ASL gene (Argininosuccinate Lyase), argininosuccinic aciduria (ASAuria; OMIM #207900), and the functional validation of WES-identified variants using a Saccharomyces cerevisiae complementation assay (ARG4 system). In detail, the case of a patient carrying two variants in cis on the maternal allele and one variant on the paternal allele will be described, resulting in a compound heterozygous genotype with a complex maternal allele p.[(Ala300Ser;Gly305Arg)] and a paternal allele p.[(Asp61Tyr)]. Functional validation of these variants was performed using a complementation assay in Saccharomyces cerevisiae , allowing to assess the effects of the variants on the protein function and improving the interpretation of genotype–phenotype correlation.

Il Whole Exome Sequencing (WES) rappresenta oggi lo strumento diagnostico di elezione per le malattie genetiche a presentazione clinica complessa, atipica o multisistemica, in cui le metodiche convenzionali non hanno consentito di identificare una causa. Mediante il sequenziamento massivo parallelo di tutte le regioni codificanti del genoma umano (~20.000 geni, ~60 Mb), il WES consente un'analisi sistematica e non ipotesi-dipendente dell'intero esoma, identificando varianti patogenetiche anche in geni associati a fenotipo clinico non inizialmente considerato. Una recente meta-analisi (Kim et al., Systematic Reviews 2025) documenta una resa diagnostica del 34,2% nelle epilessie e del 35,3% nei disturbi del neurosviluppo, significativamente superiore rispetto ai pannelli mirati (23,2%) e al Chromosomal Microarray Analysis (13,3%). Il WES trova la sua massima espressione diagnostica quando integrato con il Reverse Phenotyping (RP), definito come la rivalutazione sistematica delle caratteristiche cliniche del paziente alla luce dei risultati genetici (Jezdik et al., Genes 2024). Ogni volta che il WES rivela varianti in geni in qualche modo correlati all’ipotesi diagnostica iniziale ma non associati in maniera definitiva al quesito clinico, il RP è necessario per tradurre il dato molecolare in diagnosi clinica concreta, indagini biochimiche mirate e accesso a terapie specifiche. La necessità di RP è significativamente maggiore nei pazienti con risultati negativi alle metodiche genetiche precedenti al WES, i casi più complessi dal punto di vista diagnostico. Il presente lavoro si articola in due parti principali. La prima descrive le basi tecnologiche del WES, inclusa la metodica di preparazione delle librerie con kit Twist Bioscience e le sue specificità tecniche, le modalità di interpretazione delle varianti secondo le linee guida ACMG/AMP, e il paradigma del Reverse Phenotyping con la sua applicazione ai quadri complessi a eziologia genetica sconosciuta. La seconda parte si focalizza sul gene ASL (Argininosuccinate Lyase), sulla patologia correlata, l'aciduria argininosuccinica (ASAuria, OMIM #207900), secondo difetto del ciclo dell'urea per frequenza, e sulla caratterizzazione funzionale delle varianti identificate tramite WES in un caso clinico specifico. Nel dettaglio verrà descritto il caso di un paziente portatore di due varianti in cis sull'allele materno e una variante sull'allele paterno, configurando un eterozigote composto con genotipo p. [(Ala300Ser;Gly305Arg)];p.[(Asp61Tyr)]. La validazione funzionale delle varianti è stata eseguita mediante saggio di complementazione in Saccharomyces cerevisiae utilizzando un ceppo deleto per il gene Arg4, ortologo del gene umano ASL, contribuendo a confermare l’effetto deleterio delle varianti sulla proteina e migliorare l'interpretazione della correlazione genotipo-fenotipo.