Morphological Analysis of Dendritic Spines Reveals Altered Spine Maturation in FXS In Vivo Forebrain Organoids

Fragile X Syndrome (FXS) is the most common inherited form of intellectual disability and a leading genetic cause of autism, caused by the expansion of a CGG triplet repeat in the FMR1 gene, resulting in the loss of FMRP, a key regulator of synaptic protein synthesis. Among the main hallmarks of FXS are abnormalities in dendritic spine morphology, with spines appearing more numerous, longer and immature. Existing experimental models do not fully recapitulate human neuronal maturation; to address this, Nicola Elvassore’s laboratory developed an in vivo model based on the transplantation of FXS patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) forebrain organoids (FBO) into the mouse brain. This study aims to evaluate morphological differences in dendritic spines between FXS and Control (CTR) conditions at an early neural developmental stage. Confocal images acquired from mouse brain sections containing the transplanted organoid were analyzed using an optimized open-source Python pipeline for three-dimensional reconstruction and semi-automatic segmentation of dendritic structures. Quantitative morphological metrics were extracted from each spine and projected in R onto an in vivo reference dataset comprising four canonical spine classes — filopodia, thin, stubby, and mushroom — using an anchor-based label transfer approach, yielding a UMAP representation for direct comparison between conditions. The results show differences in spine morphology distribution between FXS and CTR samples: Control spines are predominantly assigned a mushroom morphology, consistent with a mature synaptic phenotype, while FXS spines show a higher proportion of filopodia-like morphologies, indicative of altered maturation and compromised synaptic functionality. The presence of these alterations after a total organoid maturation period of 130 days (30 days in vitro followed by 100 days in vivo) — estimated to correspond to the second trimester of human fetal brain development based on transcriptomic comparisons between forebrain organoids and human fetal cortex — suggests that synaptic defects in FXS may emerge during early phases of neuronal development and synaptogenesis. Although, due to the limited number of samples and neurons analyzed, the results obtained in this study should be considered preliminary, pending the analysis of additional samples in the coming months, with the aim of increasing the robustness of the study.

La sindrome dell'X fragile (FXS) è la forma più comune di disabilità intellettiva ereditaria e una delle principali cause genetiche di autismo, causata dall'espansione di una ripetizione del tripletto CGG nel gene FMR1, con conseguente perdita della proteina FMRP, un regolatore chiave della sintesi proteica sinaptica. Tra le principali caratteristiche della FXS vi sono anomalie nella morfologia delle spine dendritiche, che appaiono più numerose, lunghe e immature. I modelli sperimentali esistenti non replicano pienamente la maturazione neuronale umana; per ovviare a questo limite, nel laboratorio di Nicola Elvassore è stato sviluppato un modello in vivo basato sul trapianto di organoidi cerebrali (Forebrain Organoids o FBO) derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di pazienti FXS nel cervello di topo. Questo studio mira a valutare le differenze morfologiche nelle spine dendritiche tra campioni FXS e controllo (CTR) in una fase precoce dello sviluppo neuronale. Le immagini confocali acquisite da sezioni di cervello di topo contenenti l'organoide trapiantato sono state analizzate tramite una pipeline Python open-source ottimizzata per la ricostruzione tridimensionale e la segmentazione semi-automatica delle strutture dendritiche. Da ciascuna spina sono state estratte metriche morfologiche quantitative e proiettate in R su un atlas di riferimento in vivo comprendente quattro classi canoniche di spine — filopodia, thin, stubby e mushroom — tramite un approccio di label transfer basato su anchors, ottenendo una rappresentazione UMAP per il confronto diretto tra le condizioni. I risultati mostrano differenze nella distribuzione morfologica delle spine dendritiche tra campioni FXS e controllo: le spine di controllo sono prevalentemente assegnate a una morfologia mushroom, coerente con un fenotipo sinaptico maturo, mentre le spine FXS mostrano una proporzione più elevata di morfologie filopodia-like, indicative di un’alterata maturazione e una funzionalità sinaptica compromessa. La presenza di queste alterazioni dopo 130 giorni di maturazione degli organoidi (30 in vitro + 100 in vivo) — un periodo stimato corrispondere al secondo trimestre dello sviluppo cerebrale fetale umano — suggerisce che i difetti sinaptici nell'FXS emergano già durante le fasi precoci dello sviluppo neuronale e della sinaptogenesi; anche se, a causa della scarsa numerosità di campioni e neuroni analizzati, i risultati ottenuti da questo studio, sono da considerare come preliminari, in attesa di analizzare più campioni nei prossimi mesi, con l'obiettivo di aumentare la robustezza dello studio.