Biotechnological approaches for the production of polyhydroxyalkanoates from olive mill waste

The increasing global demand for olive oil has led to a progressive rise in the generation of olive mill residues, including olive mill wastewater and olive pomace (OP). The management of these by-products represents a significant environmental challenge due to their high organic load, moisture content, and abundance of phenolic compounds. Within the framework of the circular bioeconomy, sustainable valorization strategies are needed to transform these waste streams into valuable resources. This study was carried out within the OLinWASTE project, a Horizon Europefunded initiative focused on the development of an integrated and sustainable biorefinery concept for the valorization of olive mill residues. OLinWaste was established to address the growing environmental concerns associated with olive oil production, particularly the generation and management of large quantities of organic residues, while simultaneously promoting resource recovery and waste minimization strategies. This thesis investigated the feasibility of an integrated biorefinery approach for the valorization of two-phase OP through dark fermentation (DF) and the subsequent utilization of fermentation products for polyhydroxyalkanoates (PHAs) production. DF was employed to convert OP into biohydrogen and volatile fatty acids (VFAs), which can serve as platform molecules for downstream biotechnological processes. A series of Biochemical Hydrogen Potential (BHP) assays was performed to optimize the main operational parameters affecting acidogenic fermentation, including pH, thermal pre-treatment of inoculum and substrate, and incubation time. Hydrogen production, gas composition, and VFAs accumulation were monitored to evaluate process performance. The results demonstrated that mild operating conditions outperformed the more severe pre-treatments commonly applied to lignocellulosic substrates. The optimal conditions consisted of maintaining the system at native pH (6.6), applying thermal pre-treatment at 80 °C for 30 min to both inoculum and OP, and adopting an incubation time of 12 days. Under these conditions, the process achieved a maximum hydrogen yield of 7.02 NmL H₂ gVS⁻¹ and a total VFAs concentration of 29.74 g L⁻¹, while complete suppression of methanogenic activity was confirmed by the absence of methane production.9 The VFAs-rich fermentation liquor obtained under optimized conditions was subsequently evaluated as a carbon source for the cultivation of Cupriavidus necator. Growth experiments demonstrated that fermentation-derived VFAs supported bacterial growth, providing proof-of-concept evidence for integrating dark fermentation and microbial biopolymer production. Overall, the results highlight the potential of OP as a feedstock for the production of biohydrogen and VFAs-rich streams suitable for downstream bioconversion processes, supporting the development of sustainable biorefinery strategies for the olive oil industry.

La crescente domanda globale di olio d'oliva ha determinato un progressivo aumento della produzione di residui dell'industria olearia, tra cui le acque reflue di frantoio e la sansa di oliva. La gestione di questi sottoprodotti rappresenta una significativa sfida ambientale a causa dell'elevato contenuto di sostanza organica, dell'elevata umidità e della presenza di composti fenolici. Nel contesto della bioeconomia circolare, sono necessarie strategie sostenibili di valorizzazione in grado di trasformare questi flussi di scarto in risorse ad alto valore aggiunto. Il presente studio è stato condotto nell'ambito del progetto OLinWASTE, un'iniziativa finanziata dal programma Horizon Europe e incentrata sullo sviluppo di un concetto di bioraffineria integrata e sostenibile per la valorizzazione dei residui derivanti dall'industria olearia. OLinWASTE è stato concepito per rispondere alle crescenti problematiche ambientali associate alla produzione di olio d'oliva, in particolare alla generazione e alla gestione di ingenti quantità di residui organici, promuovendo al contempo strategie di recupero delle risorse e di riduzione dei rifiuti. Questa tesi ha valutato la fattibilità di un approccio di bioraffineria integrata per la valorizzazione della sansa di oliva bifase attraverso la fermentazione oscura (dark fermentation) e il successivo impiego dei prodotti di fermentazione per la produzione di poliidrossialcanoati (PHAs). La dark fermentation è stata utilizzata per convertire la sansa in bioidrogeno e acidi grassi volatili (VFAs), che possono fungere da molecole piattaforma per successivi processi biotecnologici. A tal fine, è stata condotta una serie di saggi di Biochemical Hydrogen Potential (BHP) per ottimizzare i principali parametri operativi che influenzano la fermentazione acidogenica, tra cui il pH, il pretrattamento termico di inoculo e substrato e il tempo di incubazione. La produzione di idrogeno, la composizione del gas e l'accumulo di VFAs sono stati monitorati per valutare le prestazioni del processo. I risultati hanno dimostrato che condizioni operative moderate risultano più efficaci rispetto ai pretrattamenti più severi comunemente applicati ai substrati lignocellulosici. Le condizioni ottimali individuate prevedevano il mantenimento del sistema al pH naturale (6,6), l'applicazione di un pretrattamento termico a 80 °C per 30 minuti sia all'inoculo sia alla sansa di oliva e un tempo di incubazione di 12 giorni. In tali condizioni, il11 processo ha raggiunto una produzione massima di idrogeno pari a 7,02 NmL H₂ gVS⁻¹ e una concentrazione totale di VFAs pari a 29,74 g L⁻¹. Inoltre, l'assenza di metano ha confermato la completa soppressione dell'attività metanigena. Il liquido di fermentazione ricco in VFAs ottenuto nelle condizioni ottimali è stato successivamente valutato come fonte di carbonio per la coltivazione di Cupriavidus necator. Le prove di crescita hanno dimostrato che i VFAs derivati dalla fermentazione sono in grado di sostenere la crescita batterica, fornendo una prova di fattibilità dell'integrazione tra dark fermentation e produzione microbica di biopolimeri. Nel complesso, i risultati ottenuti evidenziano il potenziale della sansa di oliva come materia prima per la produzione di bioidrogeno e correnti ricche di VFAs idonee a successivi processi di bioconversione, supportando lo sviluppo di strategie di bioraffineria sostenibili per la valorizzazione dei residui dell'industria olearia.