Ingegnerizzazione e biostampa 3D di bioink collagenici a concentrazioni stromali con controllo fine della macro- e micro-architettura.

The critical role of the extracellular matrix (ECM) has been increasingly recognized as a master regulator of cell fate, particularly in pathological contexts. In this framework, technological advances and biomaterials engineering to model the tissue complexity is fundamental to gain key insights on physical and molecular mechanisms guiding cell fate. However, although several fabrication techniques have been proposed, controlling the architectural organization of the stromal extracellular matrix (ECM), and particularly of its main component, type I collagen, remains a significant challenge. This thesis aimed to optimize a 3D bioprinting-aided process, engineering a low concentration collagen I bioink to tune the macro and micro structure of collagen constructs to recapitulate physiological properties of stromal tissues. To this end, a strategy to control and tune collagen fibrillation was explored by modulating key process parameters, including pH, temperature, time and protein concentration. Subsequently, embedded FRESH bioprinting within a TRACE support bath was employed to control collagen fibril alignment in an engineered bioink consisting of monomeric collagen mixed with a prefibrillated collagen fraction. This strategy enabled the generation of distinct isotropic and anisotropic collagen architectures, ranging from amorphous nano-fibrillar matrices to micro fibrillar structures aligned along the printing direction. Notably, uniaxial fibrillar alignment was achieved without the use of exogenous polymers, photocrosslinkers, or compositionally ill defined components. The mechanical properties of both bioinks were assessed through different tests including rheology, compression and microindentation, providing quantitative information on elastic moduli and stress-relaxation behaviour of the collagen architectures at the bulk and local level. Subsequently, to investigate how fibrillar architecture regulates cell behaviour, stromal fibroblasts were encapsulated within aligned or isotropic bioprinted collagen constructs. Remarkably, contrary to expectations derived from 2D systems, fibrillar alignment promoted significant cellular elongation while simultaneously suppressing fibroblast activation and YAP/TAZ nuclear localization compared with isotropic collagen matrices. Finally, a hollow cylindrical compartimentalized 3D tumor model was fabricated. The construct consisted of an outer fibroblast-laden collagen shell and an inner lumen containing breast cancer cells embedded in Matrigel. This compartmentalized architecture proved effective for investigating stromal–tumor cell interactions within a physiologically relevant 3D microenvironment. Overall, this work establishes a versatile platform for engineering stromal matrices with finely tunable architectures, opening new perspectives for investigating tumor stroma interactions and advancing the design of physiologically relevant cancer models.

La matrice extracellulare (ECM) è sempre più riconosciuta come regolatrice fondamentale del destino cellulare, in particolare nei contesti patologici. In questo ambito, i progressi tecnologici e l’ingegneria dei biomateriali per modellare la complessità tissutale sono essenziali per ottenere conoscenze chiave sui meccanismi fisici e molecolari che guidano il destino cellulare. Tuttavia, sebbene siano state proposte diverse tecniche di fabbricazione, il controllo dell’organizzazione architetturale della matrice extracellulare stromale, e in particolare del suo principale componente, il collagene di tipo I, rimane una sfida significativa. Questa tesi ha avuto l’obiettivo di ottimizzare un processo assistito da bioprinting 3D, ingegnerizzando un bioinchiostro a bassa concentrazione di collagene I per modulare la macro e microstruttura di costrutti di collagene, al fine di ricapitolare le proprietà fisiologiche dei tessuti stromali. A tal fine, è stata esplorata una strategia per controllare e modulare la fibrillazione del collagene attraverso la variazione di parametri chiave di processo, tra cui pH, temperatura, tempo e concentrazione proteica. Successivamente, è stato impiegata la tecnica di bioprinting FRESH all’interno di un bagno di supporto TRACE per controllare l’allineamento delle fibrille di collagene in un bioinchiostro ingegnerizzato costituito da collagene monomerico miscelato con una frazione di collagene prefibrillato. Questa strategia ha consentito la generazione di architetture di collagene isotrope e anisotrope distinte, da matrici nanofibrillari amorfe a strutture microfibrillari allineate lungo la direzione di stampa. In particolare, l’allineamento fibrillare uniaxiale è stato ottenuto senza l’impiego di polimeri esogeni, fotoreticolanti o componenti dalla composizione non ben definita. Le proprietà meccaniche di entrambi i bioinchiostri sono state valutate mediante diversi test, tra cui reologia, compressione e microindentazione, fornendo informazioni quantitative sui moduli elastici e sul comportamento di rilassamento dello stress delle architetture di collagene a livello sia macroscopico sia locale. Successivamente, per studiare in che modo l’architettura fibrillare regoli il comportamento cellulare, i fibroblasti stromali sono stati incapsulati all’interno di costrutti di collagene biostampati, allineati o isotropi. Sorprendentemente, contrariamente alle aspettative derivate dai sistemi 2D, l’allineamento fibrillare ha promosso una significativa elongazione cellulare, sopprimendo al contempo l’attivazione dei fibroblasti e la localizzazione nucleare di YAP/TAZ rispetto alle matrici di collagene isotrope. Infine, è stato fabbricato un modello tumorale 3D cilindrico cavo compartimentalizzato. Il costrutto era costituito da un guscio esterno di collagene contenente fibroblasti e da un lume interno contenente cellule di carcinoma mammario incorporate in Matrigel. Questa architettura compartimentalizzata si è dimostrata efficace per studiare le interazioni stroma–tumore all’interno di un microambiente 3D fisiologicamente rilevante. Nel complesso, questo lavoro stabilisce una piattaforma versatile per ingegnerizzare matrici stromali con architetture finemente modulabili, aprendo nuove prospettive per lo studio delle interazioni tumore-stroma e per il progresso nella progettazione di modelli di cancro fisiologicamente rilevanti.