Towards a bronchus-on-a-chip device with integrated sensing for monitoring of the cell culture

Understanding and preventing bacterial adhesion in the human airway is crucial for tackling severe respiratory infections, particularly in individuals with chronic lung conditions such as Cystic Fibrosis. The initial step in these infections is often the adhesion of pathogens, such as Burkholderia cenocepacia, to the airway epithelium via specialized adhesins, which promotes tissue colonization and inflammation. Conventional static in vitro models fail to reproduce the dynamic mechanical, chemical, and oxygen gradients characteristic of the native airway microenvironment, limiting their physiological relevance for studying host-pathogen interactions and evaluating potential therapies and drug screening. To address these limitations, this work presents the design, microfabrication, and validation of a proof-of-concept Organ-on-a-Chip (OoC) device based on cyclic olefin copolymer (COC) for the culture and monitoring of human bronchial epithelial cells (16HBE14o-). Two device prototypes were developed: a hybrid COC-PDMS platform designed to establish oxygen gradients via differential material gas permeability, and a fully COC-based platform, featuring a multi-channel dual-inlet design for controlled continuous media perfusion. Biological assessments confirmed that 16HBE14o- cells successfully proliferated on COC surfaces, supporting the suitability of the material for epithelial culture. Furthermore, continuous perfusion at 1 µL/min successfully sustained cell viability, indicating that mild dynamic shear stress supports epithelial growth. The overarching vision of this project follows a stepwise approach, transitioning from device prototyping toward real-time electrical monitoring. Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) was investigated as a quantitative, label-free, and non-invasive analytical technique to monitor epithelial barrier dynamics in real time. Gold interdigitated electrode (IDE) arrays (5 µm and 50 µm spacings) were microfabricated via photolithography and lift-off. However, electrical characterization revealed key limitations: the 50 µm spacing sensors suffered from electrical overload and electrode delamination, while the 5 µm spacing devices exhibited an ohmic short circuit due to microscopic metal bridging between fingers, which masked the interfacial electrochemical response. These findings highlight the need for further sensor optimization and validation, including the revision of lithographic lift-off protocols, implementation of pre-assembly multimeter quality checks, and advanced equivalent circuit modeling.

Comprendere e prevenire l’adesione batterica nelle vie aeree umane è fondamentale per affrontare le gravi infezioni respiratorie, in particolare nei soggetti affetti da patologie polmonari croniche, come la fibrosi cistica. La fase iniziale del processo infettivo è spesso caratterizzata dall’adesione di agenti patogeni, come Burkholderia cenocepacia, all’epitelio delle vie aeree tramite adesine specializzate, che promuovono la colonizzazione tissutale e l’infiammazione. I modelli convenzionali in vitro statici non riescono a riprodurre i gradienti meccanici, chimici e di ossigeno dinamici caratteristici del microambiente delle vie aeree, limitandone la rilevanza fisiologica per lo studio delle interazioni ospite-patogeno e per la valutazione di potenziali terapie e screening farmacologici. Per superare queste limitazioni, questo lavoro presenta la progettazione, la fabbricazione e la validazione di un dispositivo Organ-on-a-Chip (OoC) realizzato in COC per la coltura e il monitoraggio di cellule epiteliali bronchiali umane (16HBE14o-). Sono stati sviluppati due prototipi di dispositivi: una piattaforma ibrida COC-PDMS progettata per creare gradienti di ossigeno tramite la diversa permeabilità ai gas dei materiali stessi, e una piattaforma interamente realizzata in COC, caratterizzata da un design a doppio ingresso multicanale per la perfusione continua controllata del mezzo di coltura. Le valutazioni biologiche hanno confermato che le cellule 16HBE14o- aderiscono e proliferano con successo sulle superfici in COC, a supporto dell’idoneità del materiale per la coltura epiteliale. Inoltre, la perfusione continua con un flusso di 1 µL/min ha mantenuto con successo la vitalità cellulare, indicando che un lieve stress di taglio dinamico supporta la crescita epiteliale. La visione generale di questo progetto ha seguito un approccio graduale, passando dalla prototipazione del dispositivo al monitoraggio elettrico in tempo reale. Il rilevamento dell’impedenza elettrica cellula-substrato (ECIS) è stato studiato come tecnica analitica quantitativa, senza marcatori e non invasiva, per monitorare le dinamiche della barriera epiteliale in tempo reale. Sono stati microfabbricati array di elettrodi interdigitati (IDE) in oro (con spaziatura di 5 µm e 50 µm) tramite fotolitografia e lift-off. Tuttavia, la caratterizzazione elettrica ha rivelato delle limitazioni: i sensori con spaziatura di 50 µm non hanno resistito al carico elettrico applicato con conseguente delaminazione degli elettrodi, mentre i sensori con spaziatura di 5 µm hanno mostrato un cortocircuito ohmico dovuto a micro-ponti metallici tra le dita, che hanno mascherato la risposta elettrochimica interfacciale. Questi risultati evidenziano la necessità di un’ulteriore ottimizzazione e validazione degli elettrodi, inclusa la revisione dei protocolli di lift-off, l’implementazione di controlli di qualità con multimetro prima dell’assemblaggio e la modellazione avanzata di circuiti equivalenti.