Produzione, purificazione e caratterizzazione strutturale della proteasi Mpro di SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 is the etiological agent of COVID-19 disease and responsible for the pandemic of the same name. It is a virus possessing a single-stranded RNA genome capable of infecting humans by interacting with respiratory tract cells, specifically with their ACE2 receptor, via the Spike protein. The viral envelope fuses with the cell membrane, releasing the viral RNA into the cytoplasm. This polycistronic mRNA is translated into the polyproteins pp1a and pp1ab, which are subsequently processed to generate all the proteins required for viral genome replication and the assembly of new virions. Among the proteins encoded by SARS-CoV-2 RNA is the Main Protease Mpro, a cysteine protease involved in polyprotein processing that plays a critical role in the viral replication cycle, making it a primary target for antiviral drug development. Its active site consists of a catalytic dyad comprising the His41 and Cys145 residues. The protease exists as a homodimer, with one active site per monomer. Individual monomers are not biologically active, as only the dimeric form maintains the proper conformation of the substrate-binding site. Recent studies identified a novel inactive form ofMpro, termed “new-inactive”, in which the oxyanion loop is displaced compared to all other protein conformations, impairing catalytic activity due to a misaligned active site. This discovery enabled the design of inhibitors specifically tailored to bind and stabilize this inactive form. This thesis presents all the steps required to produce the Main Protease Mpro, namely recombinant expression in Escherichia coli and subsequent purification steps, to yield a contaminant-free protein. Subsequently, the protease was crystallized both in its ligand-free (apo) form and in complex with the inhibitors VC2 and Ebselen. Crystallization trials with VC2 were conducted using both the racemic mixture and both individual enantiomers. Finally, Mpro co-crystallized with the inhibitors was analyzed at a structural level. The obtained results provide new insights into the dynamics and flexibility of the protein, particularly regarding the allosteric mechanism triggered upon inhibitor binding to the active site of a single monomer.

SARS-CoV-2 è l’agente eziologico della malattia COVID-19 e responsabile della omonima pandemia. Si tratta di un virus che possiede un genoma ad RNA a singolo filamento in grado di infettare l’uomo interagendo con le cellule delle vie respiratorie, in particolare con il loro recettore ACE2, mediante la proteina Spike. Il rivestimento del virus si fonde con la membrana cellulare e l’RNA virale viene rilasciato nel citoplasma. Si tratta di un mRNA policistronico, che viene tradotto nelle poliproteine pp1a e pp1ab, le quali vengono successivamente processate per generare tutte le proteine necessarie alla replicazione del genoma virale e alla formazione di nuovi virioni. Tra le proteine codificate dall’RNA di SARS-CoV-2 c'è la Main Proteasi Mpro, una cisteina proteasi coinvolta nel processamento delle poliproteine e che riveste un ruolo fondamentale nel ciclo replicativo del virus, rappresentando quindi uno dei bersagli primari per lo sviluppo di farmaci antivirali. Il suo sito attivo consiste in una diade catalitica che comprende i residui His41 e Cys145. La proteasi si trova sotto forma di omodimero, con un sito attivo per ciascun monomero. I singoli monomeri non risultano biologicamente attivi, in quanto solo la forma dimerica permette la corretta conformazione del sito di legame al substrato. In recenti studi è stata identificata una nuova forma inattiva di Mpro, denominata “new-inactive”, in cui il loop dell’ossanione risulta spostato rispetto a tutte le altre conformazioni della proteina, compromettendo l’attività catalitica perché il sito attivo è disallineato. Questa scoperta ha permesso di progettare appositamente inibitori che legassero e stabilizzassero la forma inattiva. In questo elaborato di tesi vengono presentati tutti i passaggi necessari per produrre la Main Proteasi Mpro, quindi espressione ricombinante in Escherichia coli, e le fasi successive di purificazione, al fine di ottenere la proteina senza alcun tipo di contaminante. In seguito la proteasi è stata cristallizzata, sia in forma libera che con gli inibitori VC2 e Ebselen. Le prove di cristallizzazione con VC2 sono state condotte sia con la miscela racemica che con entrambi gli enantiomeri. Infine, Mpro co-cristallizzata con gli inibitori è stata analizzata a livello strutturale. I risultati ottenuti forniscono nuovi dettagli sulla dinamicità e la flessibilità della proteina, in particolare sul fenomeno dell’allosteria che si verifica in seguito al legame dell’inibitore nel sito attivo di un monomero.