Sviluppo di una popolazione MAGIC in zucca Kabocha: selezione dei parentali e strategie di miglioramento genetico supportate da dati NGS

Cucurbita maxima Duch. (Cucurbitaceae), which includes Kabocha-type squash, is an important vegetable crop in Italy and worldwide, which presents a wide variability of genetically diverse varieties and typologies that provide valuable germplasm material for identifying traits associated with resilience to environmental stress and for developing improved cultivars. Such resources are becoming increasingly important as drought and high-temperature events grow more frequent. This study aimed to develop and genetically validate a Multi-parent Advanced Generation Inter-Cross (MAGIC) population of C. maxima as a resource for pre-breeding, association studies, and future breeding programmes in Kabocha squash, an important commercial typology in the market. A total of 723 genotypes were analysed using double-digest restriction site-associated DNA sequencing (ddRAD-seq). The plant material comprised eight parental populations (G0), eight G1 two-way progenies, sixteen G2 four-way progenies, and the final G3 eight-way population. Sequence data processing enabled the identification of both single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and haplotypes. Overall, 8,291 haplotypic variants were identified across 3,442 haplotypic loci. These molecular data were used to assess genetic diversity, verify whether the observed pedigree structure was consistent with the expected crossing scheme, and detect possible unintended self-pollination events during population development. The genetic analyses confirmed the progressive combination of the parental genomes across the successive generations of the MAGIC scheme. Clustering based on principal component analysis (PCA) and discriminant analysis of principal components (DAPC) placed the G1 and G2 samples according to their expected parental combinations. The G3 samples showed a broad but cohesive and genetically distinct distribution, reflecting the combined contributions of the eight founder populations. A small number of G1 samples from the K5×K2 cross clustered with the K5 parental group, suggesting possible unintended self-pollination. This result highlights the value of molecular genotyping for detecting and removing progenies that do not conform to the intended crossing scheme. The genetic relationships identified by the multivariate analyses were further supported by unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) clustering. The resulting MAGIC population therefore represents a genetically validated and diverse resource for C. maxima pre-breeding and genomic research. Although traits associated with resilience to environmental stress were not phenotypically evaluated in this study, the G3 population provides a foundation for subsequent breeding phases and agronomic evaluation of the derived progenies. These may include additional generations of self-pollination to develop more homozygous lines, followed by phenotypic evaluation and association mapping. This material may therefore ultimately support the identification of favourable alleles and resilient breeding lines for the selection of improved germplasm and the development of new commercial cultivars.

Cucurbita maxima Duch. (Cucurbitaceae), che comprende le zucche di tipo Kabocha, è una coltura orticola importante in Italia e nel mondo. La specie presenta un’ampia variabilità di varietà e tipologie geneticamente diversificate, che costituiscono una preziosa fonte di germoplasma per l’identificazione di caratteri associati alla resilienza agli stress ambientali e per lo sviluppo di cultivar migliorate. Tali risorse stanno acquisendo un’importanza crescente con l’aumento della frequenza degli eventi di siccità e delle temperature elevate. Questo studio ha avuto l’obiettivo di sviluppare e validare geneticamente una popolazione Multi-parent Advanced Generation Inter-Cross (MAGIC) di C. maxima come risorsa per il pre-breeding, gli studi di associazione e i futuri programmi di miglioramento genetico della zucca Kabocha, un’importante tipologia commerciale sul mercato. Un totale di 723 genotipi è stato analizzato mediante sequenziamento del DNA associato a siti di restrizione con doppia digestione (ddRAD-seq). Il materiale vegetale comprendeva otto popolazioni parentali (G0), otto progenie G1 derivate da incroci a due vie, sedici progenie G2 derivate da incroci a quattro vie e la popolazione finale G3 derivata da incroci a otto vie. L’elaborazione dei dati di sequenziamento ha consentito di identificare sia polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) sia aplotipi. Complessivamente, sono state identificate 8.291 varianti aplotipiche distribuite su 3.442 loci aplotipici. Questi dati molecolari sono stati utilizzati per valutare la diversità genetica, verificare se la struttura genealogica osservata fosse coerente con lo schema di incrocio atteso e individuare possibili eventi indesiderati di autoimpollinazione durante lo sviluppo della popolazione. Le analisi genetiche hanno confermato la progressiva combinazione dei genomi parentali nel corso delle generazioni successive dello schema MAGIC. Le analisi di raggruppamento basate sull’analisi delle componenti principali (PCA) e sull’analisi discriminante delle componenti principali (DAPC) hanno collocato i campioni G1 e G2 in accordo con le rispettive combinazioni parentali attese. I campioni G3 hanno mostrato una distribuzione ampia, ma coesa e geneticamente distinta, che riflette il contributo combinato delle otto popolazioni fondatrici. Un numero limitato di campioni G1 derivati dall’incrocio K5×K2 si è raggruppato con il gruppo parentale K5, suggerendo possibili eventi indesiderati di autoimpollinazione. Questo risultato evidenzia l’utilità della genotipizzazione molecolare per individuare ed eliminare le progenie non conformi allo schema di incrocio previsto. Le relazioni genetiche identificate mediante le analisi multivariate sono state ulteriormente supportate dall’analisi di raggruppamento UPGMA, basata sul metodo dei gruppi appaiati non pesati con media aritmetica. La popolazione MAGIC ottenuta rappresenta pertanto una risorsa geneticamente validata e diversificata per il pre-breeding e la ricerca genomica in C. maxima. Sebbene in questo studio non siano stati valutati fenotipicamente i caratteri associati alla resilienza agli stress ambientali, la popolazione G3 costituisce una base per le successive fasi del programma di miglioramento genetico e per la valutazione agronomica delle progenie derivate. Queste fasi potranno comprendere ulteriori generazioni di autofecondazione per sviluppare linee maggiormente omozigoti, seguite dalla valutazione fenotipica e dalla mappatura per associazione. Questo materiale potrà quindi contribuire all’identificazione di alleli favorevoli e di linee resilienti di interesse per il miglioramento genetico, da utilizzare nella selezione di germoplasma migliorato e nello sviluppo di nuove cultivar commerciali.