"Functionalization of Lipid Nanoparticles for Specific Targeting: Optimization of the Post-Insertion Method for Anti-HER2 Antibody Conjugation and Validation in 2D Cell Culture Models"

The therapeutic paradigm of nucleic acid-based therapies has expanded exponentially, established by the clinical success of mRNA vaccines and therapeutics. While mRNA encapsulation within lipid nanoparticles (LNPs) provides structural protection of the cargo, improving the penetration through biological barriers and facilitates functional cytosolic delivery, achieving optimal in vivo biodistribution and cell-specific internalization remains a significant hurdle. Active targeting via surface functionalization with monoclonal antibodies offers a precise avenue to overcome non-specific clearance and enhance therapeutic efficacy, particularly in highly aggressive oncological contexts such as HER2-positive breast cancer. Among the different active targeting approaches, post-insertion represents an efficient strategy for anchoring ligands onto the surface of LNPs with appropriate antibody orientation for targeting specific receptors expressed on cancer cells. However, this approach presents intrinsic limitations that necessitate further investigation and in vitro validation to standardize this procedure and to reach statistical significance. This thesis project focus on the systematic optimization of the post-insertion technique to functionalize the pre-formed mRNA-loaded LNPs with monoclonal anti-HER2 antibody (Trastuzumab). The functionalized nanoparticles were characterized via Dynamic Light Scattering (DLS) to monitor critical parameters, specifically tracking changes in hydrodynamic diameter (size) and polydispersity index (PDI) as primary indicators of formulation stability, successful insertion and batch-to-batch homogeneity. The biological performance and targeting specificity of the optimized anti-HER2 LNPs were subsequently evaluated through in vitro experiments in two-dimensional (2D) cell cultures models. Cellular uptake efficiency was assessed using mRNA encoding Green Fluorescent Protein (GFP) as a reporter. Specificity was investigated across different biological systems, including a healthy–tumor model using MCF-10A cells and their HER2-overexpressing derivative MCF-10A-HER2+, as well as tumor models with differential HER2 expression, namely MDA-MB-231 cells (HER2-negative) and HCC breast cancer cells (HER2-positive). This experimental design enabled a comprehensive assessment of HER2-mediated targeting selectivity. These findings aim to evaluate the reproducibility of the optimized methodology, underscoring its promising potential for HER2-targeted mRNA delivery in breast cancer therapy, while outlining the future investigations required to achieve a highly robust and standardized platform.

Il paradigma terapeutico delle terapie basate sugli acidi nucleici si è espanso esponenzialmente, grazie al successo clinico dei vaccini e delle terapie a mRNA. Sebbene l'incapsulamento dell'mRNA all'interno di nanoparticelle lipidiche (LNPs) fornisca una protezione strutturale del carico, migliorando la penetrazione attraverso le barriere biologiche e facilitando il rilascio funzionale nel citosol, il raggiungimento di una biodistribuzione in vivo ottimale e di un'internalizzazione specifica delle cellule rimane un ostacolo significativo. Il targeting attivo tramite funzionalizzazione della superficie con anticorpi monoclonali offre una via precisa per superare la clearance non specifica e migliorare l'efficacia terapeutica, in particolare in contesti oncologici altamente aggressivi come il carcinoma mammario HER2-positivo. Tra i diversi approcci di targeting attivo, la post-insertion rappresenta una strategia efficiente per ancorare i ligandi sulla superficie delle LNPs con un orientamento dell’anticorpo appropriato per colpire recettori specifici espressi sulle cellule tumorali. Tuttavia, questo approccio presenta limitazioni intrinseche che necessitano di ulteriori indagini e validazioni in vitro per standardizzare questa procedura e raggiungere una rilevanza statistica. Questo progetto di tesi si concentra sull'ottimizzazione sistematica della tecnica post-inserimento per funzionalizzare le LNPs preformate che incapsulano mRNA con l'anticorpo monoclonale anti-HER2 (Trastuzumab). Le nanoparticelle funzionalizzate sono state caratterizzate tramite Dynamic Light Scattering (DLS) per monitorare i parametri critici, in particolare valutando le variazioni del diametro idrodinamico (dimensione) e dell'indice di polidispersione (PDI) come indicatori primari della stabilità della formulazione, della cinetica di inserimento efficace e dell'omogeneità del lotto oltre alla riproducibilità. Le prestazioni biologiche e la specificità di targeting delle nanoparticelle lipidiche anti-HER2 ottimizzate sono state successivamente valutate mediante esperimenti in vitro su colture cellulari bidimensionali (2D), valutando l'efficienza di assorbimento cellulare tramite l'utilizzo di mRNA codificante la proteina fluorescente verde (GFP). La specificità del sistema è stata valutata in diversi modelli biologici, includendo un sistema sano–tumorale costituito da cellule MCF-10A e dalla loro variante MCF-10A-HER2+ sovraesprimente il recettore HER2, nonché modelli tumorali caratterizzati da differente espressione di HER2, quali cellule MDA-MB-231 (HER2-negative) e cellule HCC di carcinoma mammario (HER2-positive), consentendo quindi una valutazione completa della selettività di targeting mediata da HER2. Questi risultati mirano a valutare la riproducibilità della metodologia ottimizzata, sottolineandone il promettente potenziale per la somministrazione di mRNA mirato alle cellule HER2+ nella terapia del cancro al seno, delineando al contempo le future indagini necessarie per ottenere una piattaforma altamente robusta e standardizzata.