Mechanotransduction and morphological remodeling in PDAC cells: the role of GNA15 across different extracellular matrices using in vitro hydrogel-based models

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is an aggressive malignancy with a five-year survival rate of approximately 10%, largely due to its rapid progression and early metastatic dissemination. PDAC is characterized by a dense and fibrotic stroma with altered biochemical and mechanical properties that contribute to tumour progression and therapeutic resistance. Given the central role of the extracellular matrix (ECM) in mechanotransduction, elucidating how its mechanical properties regulate tumour-cell behaviour is essential for understanding cellular adaptation within the tumour microenvironment. This thesis investigated the role of Gα15, a G protein encoded by GNA15 and ectopically expressed in transformed PDAC cells, in regulating cellular responses to distinct ECM microenvironments. The experimental approach progressed from a complex three-dimensional biomaterial-based in vitro model composed of collagen type I and hyaluronic acid, in which PDAC cell invasion was assessed across matrix formulations with distinct stiffness and viscoelastic properties, to a reductionist two-dimensional system based on functionalized polyacrylamide hydrogels (PAA-RGD) with controlled stiffnesses of 0.6, 3 and 30 kPa, allowing the specific contribution of substrate stiffness to cellular mechanotransduction to be isolated. Using PT45 cells and an IPTG-inducible shRNA system to modulate GNA15 expression, the effects of matrix stiffness and GNA15 silencing on cellular morphology, YAP nuclear localization and Cytokeratin 19 (CK19) organization were quantitatively characterized, given the role of CK19 as a marker of ductal lineage and a potential mediator of PDAC aggressiveness. At lower substrate stiffnesses, representative of less fibrotic mechanical environments that may occur during earlier stages of tumour development, GNA15 downregulation reduced the proportion of spread cells, resulting in a more rounded cellular phenotype, while increasing the area of the remaining adherent cells. These findings suggest a possible contribution of GNA15 to the early adaptation of the cytoskeleton to the mechanical properties of the surrounding matrix. At 30 kPa, a stiffness within the range associated with fibrotic tumour stroma, GNA15 depletion was associated with increased YAP nuclear localization and marked reduction and disorganization of the CK19 filamentous network. This effect was not observed on collagen I-coated hydrogels, suggesting that the response to GNA15 depletion may depend on the specific extracellular environment. Proteomic data obtained from PDAC cells revealed reduced expression of integrin subunits involved in RGD-mediated cell-matrix adhesion following GNA15 silencing, supporting the hypothesis of a potential link between GNA15 signalling, integrin-dependent adhesion and cytoskeletal remodelling. Overall, these findings suggest that GNA15 contributes to the ability of PDAC cells to adapt to changes in ECM mechanics, with its effects depending on both substrate stiffness and matrix composition. This work provides a basis for further investigating GNA15-dependent mechanotransduction and its interplay with integrin-mediated adhesion in more physiologically relevant three-dimensional tumour models.

L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è una neoplasia aggressiva, caratterizzata da un tasso di sopravvivenza a cinque anni di circa il 10%, a causa della sua rapida progressione e dell’elevata capacità di disseminazione metastatica precoce. Il PDAC è caratterizzato da uno stroma denso e fibrotico, contraddistinto da alterate proprietà biochimiche e meccaniche, che contribuiscono alla progressione tumorale e alla resistenza alle terapie. Considerato il ruolo centrale della matrice extracellulare (ECM) nella meccanotrasduzione, comprendere come le sue proprietà meccaniche regolino il comportamento delle cellule tumorali è fondamentale per chiarire i meccanismi di adattamento cellulare all’interno del microambiente tumorale. Questa tesi ha indagato il ruolo di Gα15, una proteina G codificata dal gene GNA15 ed ectopicamente espressa nelle cellule di PDAC, nella regolazione delle risposte cellulari a microambienti extracellulari diversi. L’approccio sperimentale è stato sviluppato a partire da un complesso modello in vitro tridimensionale basato su biomateriali costituiti da collagene di tipo I e acido ialuronico, nel quale è stata valutata l’invasione delle cellule di PDAC in diverse formulazioni della matrice caratterizzate da differenti proprietà di rigidezza e viscoelasticità, per poi passare a un modello bidimensionale, basato su idrogel di poliacrilammide funzionalizzati (PAA-RGD) con rigidezze controllate di 0,6, 3 e 30 kPa, che ha consentito di isolare il contributo specifico della rigidezza del substrato. Utilizzando cellule PT45 e un sistema shRNA inducibile dall’IPTG per modulare l’espressione di GNA15, sono stati caratterizzati quantitativamente gli effetti della rigidezza della matrice e del silenziamento di GNA15 su morfologia cellulare, localizzazione di YAP e organizzazione della rete di citocheratina 19 (CK19), considerando anche il ruolo di CK19 come marcatore della linea duttale e potenziale mediatore dell’aggressività del PDAC. Alle più basse rigidezze del substrato, rappresentative di ambienti meccanici meno fibrotici che possono caratterizzare le fasi più precoci dello sviluppo tumorale, la riduzione dell’espressione di GNA15 ha determinato una diminuzione della proporzione di cellule estese, con prevalenza di un fenotipo cellulare più arrotondato, accompagnata da un aumento dell’area delle cellule aderenti, suggerendo un possibile contributo di GNA15 ai processi di adattamento del citoscheletro alle proprietà meccaniche della matrice circostante. A 30 kPa, valore di rigidezza utilizzato per modellare le condizioni meccaniche di uno stroma tumorale fortemente fibrotico, il silenziamento di GNA15 è risultato associato a un aumento della localizzazione nucleare di YAP e a una marcata riduzione e disorganizzazione della rete filamentosa di CK19. Tale effetto non è stato osservato su idrogel rivestiti con collagene di tipo I, inoltre dati proteomici ottenuti da cellule di PDAC hanno evidenziato una ridotta espressione di subunità integriniche coinvolte nell’adesione cellula-matrice mediata da RGD in seguito al silenziamento di GNA15, supportando l’ipotesi di un potenziale legame tra la segnalazione mediata da GNA15, l’adesione integrina-dipendente e il rimodellamento del citoscheletro. Questi risultati suggeriscono che GNA15 contribuisca all'adattamento delle cellule di PDAC alle variazioni delle proprietà meccaniche dell'ECM, con effetti dipendenti sia dalla rigidità che dalla composizione della matrice. Questo lavoro fornisce una base per ulteriori studi volti ad approfondire la meccanotrasduzione dipendente da GNA15 e la sua interazione con i processi di adesione mediati dalle integrine in modelli tumorali tridimensionali più rappresentativi delle condizioni fisiopatologiche.