Preparazione e caratterizzazione di mutanti della tossina letale di Bacillus anthracis

B. anthracis, l’agente eziologico dell’antrace, è un batterio gram positivo, sporigeno, che secerne tre proteine distinte: antigene protettivo (PA), fattore edematogeno (EF) e fattore letale (LF). PA e LF costituiscono la tossina letale, LeTx, che è la maggior responsabile della reazione simile allo shock, caratteristica degli stadi finali dell’antrace. LF è un enzima ad attività Zn2+-endopeptidasica, che taglia specificamente le proteine MAPK chinasi (MAPKK) che fanno parte della via di trasduzione di MAPK, proteine chinasi attivate da mitogeno. Tale via è attivata da numerosi stimoli extracellulari ed è coinvolta nella proliferazione e nel differenziamento cellulari, nell’adattamento allo stress e nell’apoptosi [Widmann et al., 1999]. Recentemente è stata evidenziata un’elevata attivazione della via di MAPK in alcune neoplasie umane [Hoshino et al.,1999; Mandell et al.,1998; Salh et al., 1999]: la tossina letale è in grado di inibire la crescita di cellule trasformate, senza provocare apparente tossicità sistemica. Il suo utilizzo potrebbe costituire un futuro approccio nella terapia antitumorale. Dallo studio della struttura cristallografica di LF [Pannifer et al., 2001], è stato evidenziato, che oltre al motivo di consenso HEXXH, per la coordinazione dello Zn2+ altri due amminoacidi, E735 e Y728 sono vicini all’atomo di metallo. In particolare, E735 pare essere implicato nella coordinazione dello zinco mentre Y728 si trova ad una distanza di 3,3 Ã… dallo ione e punta l’OH dell’anello fenolico in direzione tale da suggerire un suo ruolo nella reazione di idrolisi del legame peptidico. In base a precedenti osservazioni sull’importanza di un’analoga tirosina per l’attività delle neurotossine clostridiali, Y375 per la tossina tetanica e Y366 per la tossina botulinica [Rossetto et al., 2001, Rigoni et al., 2001], si è deciso di preparare un mutante di LF che presenta un’alanina in posizione 728, LFY728A. In concomitanza sono stati prodotti sia il mutante che presenta in posizione 735 un residuo di alanina, LFE735A, sia il corrispondente mutante doppio, LFY728A; E735A. Tali mutanti sono stati caratterizzati dal punto di vista spettroscopico, ne sono state determinate le curve di denaturazione ed è stata valutata la loro attività enzimatica. I dati ottenuti permettono di suggerire un modello per il processo di idrolisi del legame peptidico catalizzato da LF. Inoltre la totale assenza di attività del doppio mutante che appare solubile e correttamente ripiegato nello spazio, lo rende un buon candidato come componente di un nuovo vaccino anti-antrace.