Silenziamento tramite RNA interference di un possibile trasportatore mitocondriale di nucleotidi

Fin’ora lo studio di trasportatori mitocondriali di deossinucleotidi nelle cellule umane ha permesso di caratterizzare funzionalmente il trasporto di dCTP e ha dimostrato che il nucleotide timidinico importato nei mitocondri è il dTMP, ma le conoscenze sul trasporto degli altri deossinucleotidi sono lacunose. Studi svolti nel nostro laboratorio hanno indagato gli scambi di dNTP attraverso la matrice mitocondriale in cellule OST TK1- silenziate per i trasportatori SLC25A33 e SLC25A36. Questi presentano elevata similarità di sequenza e sono omologhi al trasportatore di nucleotidi pirimidinici Rim2p di lievito. Sfruttando il meccanismo di RNAi si sono ottenute cellule silenziate stabilmente per slc25a33 con un plasmide esprimente uno shRNA. Il lavoro svolto durante il mio tirocinio mirava a inattivare l’espressione di slc25a33 in due linee di cellule HeLa mediante RNAi con siRNA sintetici o plasmidi codificanti shRNA. Prima ho analizzato l’espressione del trasportatore in cellule trasformate e caratterizzato la linea cellulare. Poi ho trasfettato le cellule e rilevato il livello residuo di mRNA mediante RT-PCR. Con il silenziamento stabile si è raggiunto un buon spegnimento dell’espressione di slc25a33 in cellule HeLa TK1- ma quello più efficace si è ottenuto dalla trasfezione transiente con siRNA sintetici in entrambe le linee cellulari.