Variables affecting HEK293 cells PEI-mediated transient transfection for Gag-GFP VLP production

Le particelle simil-virali (virus-like particles, VLPs) sono candidati molto promettenti per lo sviluppo di nuovi vaccini. Gli approcci per la produzione in larga scala di HIV-1 Gag VLPs si sono focalizzati principalmente nel sistema di espressione basato sui baculovirus. In questo lavoro, le HIV-1 Gag VLPs sono state prodotte utilizzando un protocollo di espressione transiente, precedentemente sviluppato e ottimizzato dal gruppo di ricerca, in coltura in sospensione di cellule di mammifero. Lo scopo di questo lavoro è di studiare le principali variabili presenti nel processo per capire quale effetto possano avere sulla trasfezione transiente delle cellule e sulla produzione stessa delle VLPs. Per facilitare la quantificazione delle VLPs, la proteina Gag viene espressa in fusione con la eGFP (enhanced Green Fluorescence Protein), generando così VLPs fluorescenti che possono essere quantificate per fluorimetria. Da studi precedenti eseguiti dal gruppo di ricerca, la grande maggioranza delle Gag-eGFP prodotte e presenti nel sopranatante della coltura sono correttamente assemblate in VLPs le quali mostrano la morfologia e le dimensioni previste, simili a quelle delle particelle virali immature dell’HIV-1. Il medium di coltura utilizzato è stato precedentemente ottimizzato per lo scopo, utilizzando il disegno di esperimenti (Design of Experiments, DoE). Il risultato è un medium di coltura supplementato con componenti di derivazione non-animale i quali comprendono proteine ricombinanti e lipidi sintetici in grado di aumentare la crescita cellulare e la produzione delle VLPs. Le cellule utilizzate sono una linea di cellule di rene di embrione umano (Human Embryonic Kidney 293, HEK293) che, in queste condizioni, crescono fino a una concentrazione di 4,8 milioni di cellule per ml se coltivate in batch. La migliore performance di produzione si ottiene quando le cellule sono trasfettate durante la loro fase di crescita esponenziale, con ricambio del medium di coltura con medium fresco al momento della trasfezione ed utilizzando concentrazioni standard di DNA plasmidico e polietilienimina (PEI). Utilizzando questo metodo, mediamente, la metà delle cellule in coltura viene trasfettata positivamente e vengono prodotti circa 2,7 miliardi di VLPs per ml. Il problema intrinseco del metodo consiste nella variabilità dell’efficienza di trasfezione che porta anche ad una variabilità nella quantità di produzione delle VLPs. In questo lavoro, i risultati ottenuti mantengono questa tendenza. Grazie a una migliore comprensione delle variabili presenti, è possibile ridurre la variabilità osservata ed aumentare la produttività. Le variabili testate sono state diverse: variabili che influenzano la formazione dei poliplessi di DNA e PEI, altre che influenzano la procedura di trasfezione ed anche variabili che non dipendono dal protocollo di trasfezione. Per quanto riguarda la formazione dei poliplessi, è stato studiato l’effetto dell’utilizzo di medium supplementato come solvente per la soluzione di DNA e PEI comparato con l’utilizzo di medium non supplementato; l’effetto della temperatura di tale medium e l’effetto del “vortex-step”. Riguardo la procedura di trasfezione sono stati studiati l’effetto dello stress cellulare dovuto al ricambio di medium e l’effetto dell’età delle beute utilizzate per il coltivo in batch. Da ultimo si è studiato l’effetto del passo cellulare, della concentrazione e della fase del ciclo cellulare al momento della trasfezione. Per studiare l’effetto della concentrazione cellulare sono stati adattati metodi di concentrazione e metodi di trasfezione alternativi. Mentre, per studiare l’effetto del ciclo cellulare sono state ottenute colture cellulari sincronizzate. Per raggiungere questo scopo due composti antineoplastici sono stati utilizzati. Di questi è stata studiata la tossicità, con saggi MTT, e il potere antineoplastico, grazie alla citometria di flusso. Per conoscere i tempi di trasfezione è stata effettuata una ricerca bibliografica i cui risultati hanno permesso di trasfettare con le tempistiche corrette le colture sincronizzate ottenute. Grazie agli studi effettuati è stato possibile concludere che il protocollo di trasfezione è robusto e non influenzato dai fattori operativi. Inoltre, è stato possibile definire un effetto positivo del medium supplementato usato per la preparazione dei poliplessi sulla vitalità cellulare ed è stata sottolineata l’importanza dello stato fisiologico delle cellule per poter ottenere buoni risultati di trasfezione e produzione. L’effetto da densità cellulare (cell density effect) è stato incontrato quando sono stati svolti esperimenti di trasfezione con concentrazione della coltura, benché, finora questo effetto sia stato descritto solamente in colture di baculovirus, tale effetto è stato evitato adattando un metodo di trasfezione alternativo. Lo studio della fase del ciclo cellulare ha posto in relazione una particolare fase del ciclo con la trasfezione, rivelando che cellule che si trovano nella fase G2/M sono più recettive alla trasfezione. Questi ultimi studi hanno evidenziato un forte effetto sulla trasfezione e sulla produzione del ricambio del medium precedente alla trasfezione, al riguardo del quale saranno necessari ulteriori approfondimenti. In chiusura vengono proposti esperimenti per risolvere i dubbi evidenziati dagli studi effettuati. Si propone nel dettaglio uno studio di microscopia confocale per ricavare i tempi precisi di trasfezione nel sistema utilizzato. Viene illustrato un metodo per eliminare l’effetto del cambio di medium negli studi sulle colture sincronizzate ed da ultimo metodi alternativi per lo studio dell’effetto della fase del ciclo cellulare.