Studente Pederzoli, Riccardo
Facoltà/Dipartimento Scuola di Scienze
Corso di studio CHIMICA Laurea Magistrale (D.M. 270/2004)
Anno Accademico 2015-07-09
Titolo originale Crystallographic Characterization of the Interaction between Protein Transthyretin and Small-Molecule Ligands
Abstract This Thesis work describes mainly Synchrotron X-rays Diffraction Studies on complexes between Transthyretin (TTR) and various ligands. TTR is a naturally-occurring protein in humans that performs different and relevant biological and physiological functions, such as the transport of Vitamin A and Thyroid Hormones, particularly T4. Nevertheless, in humans the onset of TTR point mutations can lead, in most cases, to deleterious effects for the organism. This is because such mutations induce the dissociation of TTR, which in its native state is a tetramer, and this leads to amyloid fibrils formation: these protein aggregates are the conditio sine qua non for the development of important and serious forms of amyloidosis in different organs. Liver transplantation was the first therapeutic solution to amyloidosis caused by TTR mutants: however, over the years, it became necessary to find alternatives, less invasive and easier to implement and, to date, the most promising treatment is the use of small molecules able to kinetically stabilize the TTR tetramer preventing, consequently, the dissociation. The understanding, at the molecular and structural level, of the interaction between these drugs and the specific binding sites on TTR is also an indispensable condition for a more rational design of these dissociation inhibitors, in order to obtain molecules more effective, specific and selective. The relative ease with which the TTR•ligand complexes co-crystallize, joined to the continuous advancement and progress made in the field of X-ray Diffraction with Synchrotron sources, allow to obtain three-dimensional models able to sketch out with sufficient accuracy the details of the interaction, placing the groundwork for an optimized search of most powerful candidates in the treatment of TTR amyloidosis. In addition, the structural study of complexes between TTR and various ligands has allowed not only the acquisition of more information useful for the rational design of new drugs but, at the same time, they have placed new and fascinating questions of interest not only to the community of Crystallographers. For example, it remains unclear how it is possible that the two binding sites on TTR, despite the fact that they are related by a rotation axis of order 2 (both crystallographic and molecular), are not equivalent with respect to their binding capacity, being characterized by two different affinity constants. A large part of the Thesis work involves computational processing of experimental diffraction data obtained through Synchrotron X-rays, their use in structural determination, refinement of the model and its interpretation. Among the ligands involved in the study there are thyroxine, as well as other small molecules of proven therapeutic efficacy, one of which is already on the market as commercial drug for the treatment of TTR amyloidosis. Although the structure for most of the complexes was already solved, for some of them it was possible to refine the PDB model through the analysis of crystals able to diffract to a better resolution, while, for others, it was possible to obtain for the first time the structural model. In all cases, relatively to the known structures, it has been verified that the ligands bind as already reported in the literature, with a singular exception in which the binding mode has proved to be the opposite to what was expected: for this case, two possible explanations have been advanced to justify the discrepancy between the two models. Finally, this Thesis work is also concerned with the expression and purification of another totally different protein, unrelated to TTR, the HtrA protease from Campylobacter jejuni (Cj). The goal in this case was its crystallization and structure determination through X-ray Diffraction. Cj shares several common features with microorganisms of the genus Helicobacter, among which the best known is, without any doubt, Helicobacter pylori (Hp): both are responsible for colonization of the digestive tract of most humans and for the ability, under certain conditions, to cause gastrointestinal diseases such as ulcers, gastritis and gastric cancer. In recent decades, many efforts were made to identify the factors responsible for the virulence of pathogenic strains of Campylobacter, Helicobacter and many others: however, to understand the underlying mechanism of virulence it was necessary to clarify the crystal structure of these factors and in this context the X-ray diffraction has been, and indeed still holds, the record in terms of accuracy and reliability of the information obtained through it. In the case of Hp, one of the demonstrated causes of its virulence is the HtrA protease, which plays a similar role in many other prokaryotic microorganisms. Attempts to isolate, purify and crystallize such protease, however, have proved unsuccessful because of its intrinsic instability: given the similarity with the strains of Campylobacter and the common mechanism of action of HtrA of different bacteria, it has been suggested to infer the Hp-HtrA structure from that of Cj-HtrA. Being able to obtain crystals of the latter makes possible to obtain the structure of it through SeMet isomorphous derivatives using SAD/MAD (Single- and Multi-wavelength Anomalous Diffraction) techniques or, possibly, through Molecular Replacement (MR) owing to the high sequence homology with other known HtrA. This was confirmed through Bioinformatics analysis, which has also established a high degree of homology with the amino acid sequence of the Hp-HtrA: this could be the starting point for the resolution of the Hp-HtrA structure, together with a 3D Modelling proving a good structural similarity between the two proteins. The possibility of solving, through MR, the structure of Cj-HtrA is also reinforced by the results of two independent modelling, based on the same principle, which lead to identify, in the PDB, the same structure (an HtrA from E. coli) as the most similar. The final part of the Thesis focuses on the use of Molecular Biology techniques for expression and purification of Cj-HtrA. These attempts have proven to be hard: during the different trials, it has been shown that Cj-HtrA is susceptible to degradation, through a series of intermediate fragments, and this even by adopting all the possible experimental attentions. In light of this, it was decided to continue the study on a Cj-HtrA protease having a single specific mutation in the active site, in order to reduce its proteolytic activity, increase its stability and improve, therefore, its expression. The thesis is divided into two parts: in the first chapter, the main part of the project is emphasized. In this regard, an introduction to transthyretin is presented, highlighting its biological roles, the information known about its structure and that of its complexes, its implication in various amyloidosis and the central role played by X-ray Diffraction in the search of new therapeutic molecules. Afterwards, the results obtained from processing of experimental diffraction data are presented and discussed. The second part of the work on Cj-HtrA protease is presented in Part II: after an introduction on the main bacterial strains that use it for their virulence, its functions in various organisms and structures solved to date, the results obtained after various expression and purification trials are shown and critically analyzed. Abstract (Italiano) Il presente elaborato di Tesi Magistrale concerne principalmente gli studi di Diffrazione di Raggi X prodotti da sorgente di Sincrotrone di complessi fra la proteina Transtiretina (TTR) e diversi suoi leganti. La Transtiretina è naturalmente presente nell’organismo umano (e non solo) dove assolve importanti funzioni fisiologiche e biologiche, fra le quali si annoverano il trasporto della Vitamina A e degli ormoni tiroidei, particolarmente T4. Tuttavia, diverse sono le cause che, nell’uomo, possono determinare l’insorgenza di mutazioni puntiformi della TTR e che, abbastanza spesso, si rivelano deleterie per l’organismo. Questo avviene perché le mutazioni inducono la dissociazione della TTR, che allo stato nativo è un tetramero, a formare fibrille amiloidi le quali rappresentano la conditio sine qua non per lo sviluppo di importanti e gravi forme di amiloidosi a carico di diversi organi. Il trapianto di fegato ha rappresentato la prima soluzione terapeutica alle amiloidosi causate da mutanti della TTR: tuttavia, nel corso degli anni si è reso necessario trovare alternative meno invasive e di più facile attuazione e, ad oggi, il trattamento più promettente riguarda l’uso di piccole molecole in grado di stabilizzare cineticamente il tetramero della TTR, prevenendone di conseguenza la dissociazione. La comprensione, a livello molecolare e strutturale, dell’interazione fra questi farmaci e i siti di legame specifici sulla TTR rappresenta anch’essa una condizione indispensabile per un disegno più mirato e razionale di tali inibitori della dissociazione, al fine di ottenere molecole sempre più efficaci, specifiche e selettive. La possibilità di co-cristallizzare la TTR insieme a diversi leganti, congiuntamente ai continui avanzamenti e progressi ottenuti nel campo della Diffrazione di Raggi X con sorgente di Sincrotrone, permette di ottenere modelli tridimensionali capaci di delineare con sufficiente accuratezza i dettagli dell’interazione, ponendo così le basi per una ricerca ottimizzata di candidati più potenti nel trattamento delle amiloidosi da TTR. In aggiunta, lo studio strutturale dei complessi fra la TTR e vari leganti ha permesso non solo di acquisire maggiori informazioni utili per il design razionale di nuovi farmaci ma ha, nel contempo, posto nuovi ed affascinanti interrogativi d’interesse non solo alla comunità dei Cristallografi. Ad esempio, rimane ancora da chiarire come sia possibile che i due siti di legame della TTR, nonostante il fatto che siano correlati da un asse di rotazione di ordine 2 (sia cristallografico che molecolare), non siano però equivalenti rispetto alla loro capacità di legame, in quanto caratterizzati da due differenti costanti di affinità. Larga parte del presente lavoro di Tesi riguarda l’elaborazione computazionale di dati provenienti dall’analisi di cristalli di complessi TTR•legante attraverso Raggi X ottenuti da Sincrotrone, il loro utilizzo nella determinazione strutturale, affinamento del modello e sua relativa interpretazione. Fra i leganti coinvolti nello studio, si annovera il legante naturale T4, così come altre piccole molecole di comprovata efficacia terapeutica, una delle quali già sul mercato come farmaco commerciale per il trattamento delle amiloidosi da TTR. Nonostante di parte dei complessi fosse già nota la struttura, per alcuni di essi si è stati in grado di perfezionare il modello precedente attraverso l’analisi di cristalli capaci di diffrangere ad una migliore risoluzione, mentre per altri è stato ottenuto per la prima volta il modello strutturale. In tutti i casi, relativamente alle strutture note, è stato verificato dai dati sperimentalmente ottenuti che il legante si lega come già riportato in letteratura, con una singolare eccezione nella quale la modalità di binding si è rivelata essere opposta a quanto atteso: per questo caso, due soluzioni in grado di spiegare l’incongruenza fra i due modelli strutturali sono state avanzate. Infine, il presente lavoro di Tesi ha riguardato anche l’espressione e la purificazione della proteasi HtrA da Campylobacter jejuni (Cj), con l’intento di riuscire a cristallizzarla e poterne determinare la struttura attraverso la diffrazione di raggi X. Cj condivide diverse caratteristiche con i microorganismi del genere Helicobacter di cui il più noto è, con tutta probabilità, Helicobacter pylori (Hp): con esso condivide, ad esempio, la colonizzazione dell’apparato digerente della maggior parte degli esseri umani (e non solo) e la capacità, in determinate condizioni, di determinare l’insorgenza di patologie gastrointestinali di varia natura fra cui ulcere, gastriti e neoplasie gastriche. Negli ultimi decenni, molti sforzi sono stati profusi nell’identificare i fattori di virulenza responsabili per la patogenicità dei ceppi di Campylobacter, Helicobacter e molti altri: per comprendere, però, il meccanismo alla base della loro virulenza è stato necessario chiarire la struttura di tali fattori, e in questo contesto la Diffrazione di Raggi X ha avuto, e del resto detiene ancora, il primato in termini di accuratezza ed attendibilità delle informazioni ottenibili attraverso essa. Nel caso di Hp, una delle cause dimostrate della sua virulenza è da imputare alla proteasi HtrA, che gioca un ruolo analogo in molti altri organismi procarioti. Tentativi di isolare, purificare e cristallizzare tale proteasi si sono però rivelati vani a causa della sua instabilità: data la similitudine con i ceppi di Campylobacter ed il comune meccanismo di azione delle HtrA dei diversi batteri, è stata avanzata l’ipotesi di inferire la struttura dell’HtrA di Hp da quella della HtrA di Cj. Riuscire ad ottenere i cristalli di quest’ultima permetterebbe di ottenerne la struttura attraverso i SeMet derivati isomorfi sfruttando le tecniche SAD/MAD o, come si ritiene più probabile, attraverso Molecular Replacement (MR) data l’alta omologia di sequenza con altre HtrA note. Ciò è stato confermato attraverso un’analisi Bioinformatica, la quale ha oltremodo sancito un’elevata omologia della sequenza amino acidica anche con la proteasi HtrA di Hp: questo potrebbe essere il punto di partenza per la risoluzione (con metodi ab initio o attraverso Molecular Dynamics) della struttura della HtrA di Hp, insieme ad un Modelling 3D che comprovi una buona somiglianza strutturale fra le due proteine. La possibilità di risolvere, attraverso MR, la struttura della HtrA di Cj è rafforzata anche dal risultato di due Modelling indipendenti, ma basati sullo stesso principio, che portano ad identificare, nel PDB, la stessa struttura (una HtrA di E. coli) come la più affine dal punto di vista strutturale. La parte sperimentale della Tesi ha riguardato l’utilizzo degli strumenti della Biologia Molecolare per l’espressione e la purificazione dell’HtrA di Cj. Tali tentativi si sono tuttavia rivelati ardui: durante le diverse prove, è stato infatti dimostrato che la proteasi HtrA da Cj è suscettibile a facile degradazione, attraverso una serie di frammenti intermedi, e questo anche adottando le maggiori accortezze sperimentali. Alla luce di ciò, è stato deciso di proseguire lo studio su una proteasi HtrA da Cj avente una mutazione specifica nel sito attivo, in modo tale da ridurne l’attività proteolitica, aumentarne la stabilità e migliorare, quindi, la sua espressione, purificazione e cristallizzazione. La Tesi è suddivisa in due parti: nel primo capitolo viene dato risalto alla parte principale del Progetto. A tal proposito, si presenta un’introduzione alla Transtiretina, evidenziando i suoi ruoli biologici, le informazioni note riguardo la sua struttura e quella dei suoi complessi, la sua implicazione in diverse amiloidosi ed il ruolo centrale rivestito dalla Diffrazione di Raggi X per la ricerca di nuove molecole terapeutiche. Quindi, sono presentati e discussi i risultati ottenuti dall’elaborazione dei dati sperimentalmente ottenuti. La seconda parte dell’elaborato, invece, concerne la proteasi HtrA da Cj: dopo un’introduzione sui principali ceppi batterici che la utilizzano ai fini della loro virulenza, sulle sue funzioni in vari organismi e sulle strutture ad oggi risolte, vengono mostrati e analizzati criticamente i risultati ottenuti a seguito delle diverse prove di espressione e purificazione effettuate.
Numero di pagine 109
Parola chiave Transthyretin (TTR), amyloid fibrils, TTR Amyloidosis, Amyloidogenesis, Small-molecule ligands, Asymmetric ligand binding, TTR•ligand complexes, HtrA protease, Campylobacter jejuni, Protein Purification and over-expression.
Relatore Zanotti, Giuseppe
Correlatore Battistutta, Roberto
Appare nelle tipologie: Lauree magistrali
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