Studi funzionali volti a chiarire il ruolo della metilazione nel silenziamento genico: un caso studio nel linfoma del cane.

Numerosi studi condotti nell’uomo dimostrano come la metilazione del DNA sia in grado di determinare un’inibizione dell’espressione genica, e che tale meccanismo di silenziamento genico sia sfruttato in alcuni tumori per il silenziamento di geni oncosoppressori. Nel cane, questa tipologia di studi è ancora agli albori e le informazioni a disposizione sono tuttora limitate. Il progetto, in cui il presente lavoro di tesi si inserisce, ha come obiettivo lo studio del ruolo della metilazione del DNA nella regolazione dell’espressione dei geni oncosoppressori CiDEA, MAL e PCDH17, nel Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) del cane, e di definire i meccanismi molecolari alla base di tale relazione. Il potenziale ruolo della metilazione nel controllo dell’espressione dei tre geni è stato oggetto di studio nella prima parte della tesi, attraverso un saggio di gene reporter assay. Si è dunque proceduto con il clonaggio delle regioni CpG island (CGI) dei geni di interesse a monte del gene reporter per la luciferasi Firefly, all’interno del plasmide pCpGL-basic, privo di sequenze CpG. Per le prove di trasfezione è stata scelta la linea cellulare di timo di cane CF2Th, selezionata attraverso il confronto di diverse linee cellulari di cane, e per la quale è stato messo a punto un protocollo di trasfezione. Nella linea sono state eseguite tre prove di trasfezione indipendenti con i costrutti non metilati, che hanno permesso di definire le regioni CGI importanti nel controllo della trascrizione dei tre geni. Le regioni, risultate essere rilevanti nel controllo dell’espressione genica, sono state sottoposte alla reazione di metilazione con enzimi dotati di attività metiltransferasica e successivamente a trasfezione. Attraverso le prove di metilazione e l’utilizzo di un gene reporter assay, è stato possibile definire: in primo luogo, la relazione tra la metilazione delle CGI ed il silenziamento genico; in secondo luogo, quali siti all’interno delle CGI, soggetti a metilazione, potessero potenzialmente avere un ruolo di maggiore rilevanza nel controllare l’espressione genica in vitro. Nell’ultima parte di questo lavoro, attraverso l’utilizzo di specifici software e combinando i risultati ottenuti dalle prove di trasfezione, è stata eseguita un’analisi predittiva in silico dei potenziali siti riconosciuti dai fattori di trascrizione, per cercare di definire quali delle 2 regioni sottoposte a metilazione potrebbero essere di maggiore interesse per il controllo dell’espressione genica e da approfondire in studi futuri.