Biological characterization of cells encapsulated in photo-crosslinkable Hyaluronic Acid- and Gelatin-based bioinks for 3D bioprinting

Osteoarthritis (OA) is a chronic degenerative disease that affects the joints and causes a progressive degradation of articular cartilage, causing distress, pain, and movement limitations. This disease affects mostly elderly, women and obese people, while the joint that is most frequently hit is the knee. Articular cartilage is composed by connective tissue, as a non-vascularized tissue it has limited ability of regeneration, and the treatments that are nowadays approved for OA are limited and unable to block or reverse the pathology progression: analgesic and anti-inflammatory drugs, viscosupplements, or arthroplasty. The formers reduce only the pain, the seconds require frequent and repeated injections, while in the latter the implant of articular prothesis with non-resorbable material can be associated with repeated revisions/substitutions. A recent technology, 3D Bioprinting, a 3D Printing branch, allows the printing of biopolymers containing, or not, cells (bioinks) with the goal to form substitutive structures for the patients’ defects. This technology is interesting because with the printing of bioinks containing autologous chondrocytes, is theoretically feasible to substitute the articular defect with resorbable prothesis and with similar stiffness of the original tissue. The target of this thesis is the biological characterization of cells encapsulated in high-viscosity photocrosslinkable Hyaluronic Acid- (HA) and Gelatin- based bioinks. In the first part of this thesis, the synthesis of HA and Gelatin derivatives is described, produced with protocols previously explored and patented by Fidia Farmaceutici S.p.A. The derivatives are functionalized with a coumarin unit, called Umbelliferon (or 7-hydroxycoumarin), bound to the biomolecule through a linker, while the analysis of the Degree of Substitution (DSmol) of the derivatives is carried out using UV/vis spectroscopy and HPLC-UV techniques. In the second part, it is described the preparation of different formulations (INKs), characterized with amplitude sweep, dynamic viscosity, porosity, and swelling measurements, in order to predict the behavior during and after 3D printing. Finally, the encapsulation of murine fibroblasts (BALB/3T3) in the INKs is performed, with cell viability analysis using LIVE/DEAD and AlamarBlue assays, genetic markers expression analysis through qRT-PCR and cellular markers expression analysis through immunofluorescence.

L’osteoartrosi (OA) è una malattia degenerativa cronica a carico delle articolazioni che comporta una graduale degradazione della cartilagine articolare, causando sconforto, dolore e limitazione nei movimenti. Questa malattia colpisce maggiormente anziani, donne e persone affette da obesità e l’articolazione maggiormente soggetta a questa degradazione è il ginocchio. La cartilagine articolare fa parte del tessuto connettivo, è un tessuto non vascolarizzato con limitata possibilità di rigenerazione, e i trattamenti attualmente approvati per l’OA sono limitati e non in grado di bloccare o invertire la progressione della patologia: uso di analgesici e antinfiammatori, visco-supplementazione o artroplastica. I primi riducono il dolore, la seconda richiede continue iniezioni di viscosupplementi, mentre nell’ultima l’impianto di protesi articolari con materiali non riassorbibili può richiedere continue revisioni/sostituzioni. Una tecnologia recente, il 3D Bioprinting, branca del 3D Printing, permette la stampa di biopolimeri contenenti o meno cellule (bioinks) con lo scopo di formare strutture sostitutive dei difetti dei pazienti. Questa tecnologia risulta interessante in quanto con la stampa di bioinks contenenti condrociti autologhi è teoricamente possibile sostituire il difetto articolare con protesi riassorbibili e con durezza molto simile al tessuto originale. Lo scopo di questa tesi è la caratterizzazione biologica di cellule incapsulate nei bioinks ad elevata viscosità a base di derivati fotocrosslinkabili di Acido Ialuronico (HA) e Gelatina. Nella prima parte dell’elaborato viene descritta la sintesi dei derivati di HA e Gelatina, tramite procedure esplorate e brevettate in precedenza da Fidia Farmaceutici S.p.A. I derivati vengono funzionalizzati con una unità cumarinica, chiamata Umbelliferone (o 7-idrossicumarina), legata mediante linker alla biomolecola, mentre l’analisi del grado di sostituzione (DSmol) dei derivati viene effettuata tramite spettrofotometria UV/vis e HPLC-UV. Nella seconda parte è descritta la modalità di preparazione delle diverse formulazioni (INKs), con successive misure di amplitude sweep, viscosità dinamica, porosità e swelling, in modo da prevedere il comportamento durante e dopo la stampa 3D. Infine, è riportato l’incapsulamento di fibroblasti murini (BALB/3T3) negli INKs, con successiva analisi di vitalità cellulare tramite saggi LIVE/DEAD e AlamarBlue, analisi di espressione di marker genetici via qRT-PCR e di marker cellulari via immunofluorescenza.