Progettazione e produzione di varanti stabili dei domini strutturati del fattore di trascrizione AhR (Aryl hydrocarbon Receptor)

Il recettore AhR (“Aryl hydrocarbon Receptor”), appartenente alla superfamiglia di fattori di trascrizione bHLH-PAS, è in grado di mediare, attraverso differenti meccanismi molecolari, una risposta specifica a diversi fattori ambientali o xenobiotici ed è dunque coinvolto nell’omeostasi cellulare e in un’ampia varietà di disturbi infiammatori e neoplastici. Tra i domini che compongono il recettore, il PAS-B domain (Per-ARNT-Sim) rappresenta il dominio di legame al ligando, una regione strutturale fondamentale per l’attivazione ligando-mediata e per la risposta al segnale di Ahr. Il dominio PAS-B non è ancora stato caratterizzato strutturalmente dal punto di vista sperimentale, non è dunque ancora possibile decifrare in maniera precisa l’impatto dei diversi ligandi sulla struttura e sulla dinamica del dominio AhR. Diventa perciò di vitale importanza risolvere la struttura di PAS-B poiché permetterebbe di conoscere nel dettaglio la regolazione e la funzione dell’intero recettore nucleare AhR. L’interesse e lo scopo della mia tesi è stato la progettazione e conseguente produzione di varianti stabili del dominio PAS-B come proteina ricombinante nel sistema di espressione eterologo Escherichia coli. In particolare, si sono progettate le sequenze peptidiche più appropriate del dominio PAS-B di AhR e del suo partner d’interazione Arnt e successivamente sono stati eseguiti i diversi clonaggi in vettori plasmidici adeguati per l’espressione della proteina. In uno stadio successivo, effettuando una serie di prove sperimentali, ci si è dedicati a prove di espressione e co-espressione in Escherichia coli delle relative proteine ricombinanti e alla loro purificazione tramite tecniche cromatografiche, al fine di ottenere una proteina stabile in soluzione utile alla futura caratterizzazione della sua struttura tridimensionale e delle funzioni in cui il recettore stesso è implicato.