Definizione di metodi di coltura cellulare per lo studio della staminalità e del differenziamento nell'ascidia Botryllus schlosseri

L’utilizzo di colture cellulari è un’ottima strategia per eseguire studi ed analisi in vitro. Nell’ambito dei vertebrati, le ricerche sono piuttosto avanzate, mentre in quello degli invertebrati, per molti organismi, è ancora necessario stabilire un protocollo per il mantenimento di colture cellulari a medio-lungo termine. Botryllus schlosseri è un’ascidia coloniale appartenente al subphylum dei Tunicati. La sua tunica trasparente che favorisce ottime osservazioni in vivo, la sua facile reperibilità, la possibilità di realizzare facilmente cloni sono solo alcune delle caratteristiche che lo rendono un organismo modello in molti ambiti sperimentali. Interessante è anche la sua modalità di riproduzione, che comprende la formazione di una larva per via sessuata (fecondazione interna) e la formazione delle varie componenti della colonia (zooidi) per via asessuata. In questo organismo, sono presenti nicchie di cellule staminali adulte somatiche e germinali, le quali possiedono talune caratteristiche comuni alle nicchie di cellule staminali dei mammiferi. Ciò evidenzia l’importanza di studiare queste cellule. Lo scopo di questo lavoro è proprio quello di realizzare e mantenere colture cellulari con cellule staminali di Botryllus schlosseri, sperimentando differenti tecniche. Sono stati eseguiti 4 esperimenti di separazione di popolazioni cellulari al FACS, attraverso i quali sono state selezionate le cellule candidate staminali (dimensioni medio-piccole e assente granulosità). Queste cellule, suddivise in 4 popolazioni in base alle loro dimensioni, sono state messe in coltura, utilizzando il terreno RPMI 1640 modificato. Nel corso dei vari esperimenti, le metodologie utilizzate sono state man mano cambiate e migliorate, ai fini di individuare la giusta tecnica per il mantenimento della coltura. Le cellule sono state osservate quotidianamente al microscopio rovesciato; sono state eseguite estrazioni di DNA, di RNA e successive PCR, con gli obiettivi di verificare se le cellule sopravvissute in coltura fossero di B. schlosseri e di valutare le variazioni di espressione dei fattori di staminalità e differenziamento. I risultati della tesi rappresentano spunti preliminari per la messa a punto delle tecniche di coltura cellulare.