Peptaibols are a class of short length linear peptides of 5-20 residues with non-canonical amino acids produced by non-ribosomal peptide synthetase (NRPS). Several species of Trichoderma are well-known producers of these secondary metabolites, which show potential antimicrobial activity against fungi and Gram-positive bacteria. Tricholongin B1 and trichogin are two well characterized peptaibols that could be promising as antifungal molecules to be used for crop protection. In this thesis, two parallel approaches were followed. First, Tricholongin B1 was heterologously expressed in the yeast Pichia pastoris to verify the possibility of producing higher amounts of peptide, which then could be chemically modified to introduce non-canonical amino acids in the sequence. The production of the peptide was successfully achieved and identified by SDS-PAGE with silver staining. In the second approach, the chemically synthesized Trichogin 4r (pep4R) was used to treat the fungal pathogen Botrytis cinerea. Pep4R inhibitory activity against this fungus has been previously verified. However, the high production cost limits its applicability in crop protection. With the aim of reducing the dose, the effect of a combined treatment with the natural antimicrobial compound eugenol was assessed. B. cinerea growth inhibition with single and combined treatment was measured and the EC50 values for both eugenol (0.5 mM) and pep4R (6 M) were obtained. However, at the tested concentrations, an antagonist interaction was observed with an index of fractional minimal inhibitory (FIC) of 85.342. B. cinerea was then treated with Eugenol and pep4R, either separately or together, for 1h and 3h to perform RNAseq analysis for a deeper understanding of their antifungal interaction. The 28S/18S ratios obtained for the extracted RNAs of Control, Eugenol, pep4R and Eugenol plus pep4R treatments were 0.9, 1.0, 1,0 and 1.4, respectively. These samples have been subjected to RNA-seq analysis.

I peptaibol sono una classe di peptidi lineari di breve lunghezza di 5-20 residui con amminoacidi non canonici prodotti dalla peptide sintetasi non ribosomiale (NRPS). Diverse specie di Trichoderma sono noti produttori di questi metaboliti secondari, che mostrano una potenziale attività antimicrobica contro funghi e batteri Gram-positivi. Tricholongin B1 e trichogin sono due peptaibol ben caratterizzati che potrebbero essere promettenti come molecole antimicotiche da utilizzare per la protezione delle colture. In questa tesi sono stati seguiti due approcci paralleli. In primo luogo, la Tricholongina B1 è stata espressa in modo eterologo nel lievito Pichia pastoris per verificare la possibilità di produrre quantità maggiori di peptide, che poi potrebbe essere modificato chimicamente per introdurre nella sequenza amminoacidi non canonici. La produzione del peptide è stata ottenuta con successo e identificata mediante SDS-PAGE con colorazione argento. Nel secondo approccio, il Trichogin 4r (pep4R) sintetizzato chimicamente è stato utilizzato per trattare il patogeno fungino Botrytis cinerea. L'attività inibitoria di Pep4R contro questo fungo è stata precedentemente verificata. Tuttavia, l'alto costo di produzione ne limita l'applicabilità nella protezione delle colture. Con l'obiettivo di ridurre la dose, è stato valutato l'effetto di un trattamento combinato con il composto antimicrobico naturale eugenolo. È stata misurata l'inibizione della crescita di B. cinerea con trattamento singolo e combinato e sono stati ottenuti i valori di EC50 sia per eugenolo (0,5 mM) che per pep4R (6 M). Tuttavia, alle concentrazioni testate, è stata osservata un'interazione antagonista con un indice di frazione inibitoria minima (FIC) di 85,342. B. cinerea è stato quindi trattato con Eugenolo e pep4R, separatamente o insieme, per 1 ora e 3 ore per eseguire l'analisi RNAseq per una comprensione più profonda della loro interazione antimicotica. I rapporti 28S/18S ottenuti per gli RNA estratti dei trattamenti Control, Eugenol, pep4R ed Eugenol più pep4R erano rispettivamente 0,9, 1,0, 1,0 e 1,4. Questi campioni sono stati sottoposti ad analisi RNA-seq.

Peptidi non ribosomiali come nuovi agrofarmaci: espressione eterologa di tricolongina B1 in Pichia Pastoris e attività sinergica antimifungina di tricogina 4r ed eugenolo

ÁLVAREZ GRIJALVA, ANA LAURA
2021/2022

Abstract

Peptaibols are a class of short length linear peptides of 5-20 residues with non-canonical amino acids produced by non-ribosomal peptide synthetase (NRPS). Several species of Trichoderma are well-known producers of these secondary metabolites, which show potential antimicrobial activity against fungi and Gram-positive bacteria. Tricholongin B1 and trichogin are two well characterized peptaibols that could be promising as antifungal molecules to be used for crop protection. In this thesis, two parallel approaches were followed. First, Tricholongin B1 was heterologously expressed in the yeast Pichia pastoris to verify the possibility of producing higher amounts of peptide, which then could be chemically modified to introduce non-canonical amino acids in the sequence. The production of the peptide was successfully achieved and identified by SDS-PAGE with silver staining. In the second approach, the chemically synthesized Trichogin 4r (pep4R) was used to treat the fungal pathogen Botrytis cinerea. Pep4R inhibitory activity against this fungus has been previously verified. However, the high production cost limits its applicability in crop protection. With the aim of reducing the dose, the effect of a combined treatment with the natural antimicrobial compound eugenol was assessed. B. cinerea growth inhibition with single and combined treatment was measured and the EC50 values for both eugenol (0.5 mM) and pep4R (6 M) were obtained. However, at the tested concentrations, an antagonist interaction was observed with an index of fractional minimal inhibitory (FIC) of 85.342. B. cinerea was then treated with Eugenol and pep4R, either separately or together, for 1h and 3h to perform RNAseq analysis for a deeper understanding of their antifungal interaction. The 28S/18S ratios obtained for the extracted RNAs of Control, Eugenol, pep4R and Eugenol plus pep4R treatments were 0.9, 1.0, 1,0 and 1.4, respectively. These samples have been subjected to RNA-seq analysis.
2021
Nonribosomal peptides as new agrochemicals: heterologous expression of tricholongin B1 in Pichia Pastoris and synergistic antifungal activity of trichogin 4r and eugenol
I peptaibol sono una classe di peptidi lineari di breve lunghezza di 5-20 residui con amminoacidi non canonici prodotti dalla peptide sintetasi non ribosomiale (NRPS). Diverse specie di Trichoderma sono noti produttori di questi metaboliti secondari, che mostrano una potenziale attività antimicrobica contro funghi e batteri Gram-positivi. Tricholongin B1 e trichogin sono due peptaibol ben caratterizzati che potrebbero essere promettenti come molecole antimicotiche da utilizzare per la protezione delle colture. In questa tesi sono stati seguiti due approcci paralleli. In primo luogo, la Tricholongina B1 è stata espressa in modo eterologo nel lievito Pichia pastoris per verificare la possibilità di produrre quantità maggiori di peptide, che poi potrebbe essere modificato chimicamente per introdurre nella sequenza amminoacidi non canonici. La produzione del peptide è stata ottenuta con successo e identificata mediante SDS-PAGE con colorazione argento. Nel secondo approccio, il Trichogin 4r (pep4R) sintetizzato chimicamente è stato utilizzato per trattare il patogeno fungino Botrytis cinerea. L'attività inibitoria di Pep4R contro questo fungo è stata precedentemente verificata. Tuttavia, l'alto costo di produzione ne limita l'applicabilità nella protezione delle colture. Con l'obiettivo di ridurre la dose, è stato valutato l'effetto di un trattamento combinato con il composto antimicrobico naturale eugenolo. È stata misurata l'inibizione della crescita di B. cinerea con trattamento singolo e combinato e sono stati ottenuti i valori di EC50 sia per eugenolo (0,5 mM) che per pep4R (6 M). Tuttavia, alle concentrazioni testate, è stata osservata un'interazione antagonista con un indice di frazione inibitoria minima (FIC) di 85,342. B. cinerea è stato quindi trattato con Eugenolo e pep4R, separatamente o insieme, per 1 ora e 3 ore per eseguire l'analisi RNAseq per una comprensione più profonda della loro interazione antimicotica. I rapporti 28S/18S ottenuti per gli RNA estratti dei trattamenti Control, Eugenol, pep4R ed Eugenol più pep4R erano rispettivamente 0,9, 1,0, 1,0 e 1,4. Questi campioni sono stati sottoposti ad analisi RNA-seq.
Peptaibols
Agrochemicals
Trichoderma
Trichogin
Tricholongin
File in questo prodotto:
File Dimensione Formato  
AlvarezGrijalva_AnaLaura.pdf

accesso riservato

Dimensione 1.23 MB
Formato Adobe PDF
1.23 MB Adobe PDF

The text of this website © Università degli studi di Padova. Full Text are published under a non-exclusive license. Metadata are under a CC0 License

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.12608/37235