Studio delle comunità microbiche in cereali autunno-vernini insilati addizionati con batteri lattici Omofermentanti ed Eterofermentanti

Ensiling is a very old technique that allows the prolonged preservation of fodder used in animal feed. In the absence of O2 there is the development of anaerobic microorganisms that ferment sugars resulting in the acidification of the plant mass, increasing its stability, nutritional and microbiological quality. The production of lactic acid by Lactic Acid Bacteria (LAB) turns out to be the main factor that promotes silage stability due to the reduction and maintenance of the pH of the silage mass at values below 4 throughout the ensiling period. LAB are microorganisms naturally present in fresh forage but often their low concentration does not allow the establishment of a good fermentation process and this compromises the quality of the final product. Therefore, starter cultures of LAB (inoculums) are very often used to improve the fermentation process and achieve the desired fermentation with more margin of safety. This study has focused on the use of two different starter cultures of LAB , one consisting of obligate Heterofermenting lactic acid bacteria (Lactobacillus buchneri, KWS LACTOSTABILITY) and the other consisting of a mixture of Homofermenting lactic acid bacteria (KWS LACTOQUALITY). Each inoculum was added to three chopped, wheat or mixed oat wheat harvested from three different farms in the Veneto region. Each chopped was divided into three equal fractions to which either one of the two inoculums or water (control) was added. Different aliquots of each chop were ensiled for a time of 6 days (T6) or 60 days (T60). The objective of this thesis was to evaluate how the two different starters affected the development of microbial communities during the fermentation process and how these affected the quality of the final product (pH). Furthermore, the possible influence of the dry matter (DM) content of fresh chopped on the evolution of fermentation and microbial community was evaluated. Two different approaches were used for this purpose: culture-dependent and culture-independent. In the former, specific media were used for the isolation and plate counts of three specific targets: Lactic Bacteria, Total Mesophilic Charge (CMT) and Molds and Yeasts; typical colonies of lactic acid bacteria, molds and yeasts were isolated, amplified by PCR and subjected to Sanger sequencing of the 16S rRNA/ ITS 1 and ITS 2 gene for species identification. Using the Metabarcoding approach, a portion of the same 16S rRNA gene was analyzed and sequenced using Illumina® Miseq 2x300 platform in order to study and characterize the evolution of microbial communities from the beginning to the end of the fermentation process. Among the main effects resulting from the use of starter cultures detected in this in this study is how the use of the two starters promoted LAB competition over native anaerobic flora. The heterofermenting starter resulted in a significant increase in LAB at the end of fermentation compared to the control and homofermenting starter. However, the latter allowed higher acidification (pH< 4.01) of the silages at the end of 60 days, and the lower pH values correlated with higher product quality and shelf life. The different levels of dry matter (DM) of the samples influenced the evolution of the microbial community at the end of fermentation, and high levels of DM (43.4%) seemed to favor the persistence of heterofermentative LAB more at the end of fermentation.

L’insilamento è una tecnica molto antica che permette la conservazione prolungata di foraggi impiegati nell’alimentazione animale. In assenza di O2 vi è lo sviluppo dei microorganismi anaerobi che fermentando gli zuccheri determinano l’acidificazione della massa vegetale aumentandone la stabilità, la qualità nutrizionale e quella microbiologica. La produzione di acido lattico da parte dei Batteri Lattici (Lactic Acid Bacteria LAB) risulta essere il principale fattore che favorisce la stabilità dell’insilato poiché determina la riduzione e il mantenimento del pH della massa vegetale a valori inferiori a 4 per tutto il periodo di insilamento. I LAB sono microorganismi naturalmente presenti nel foraggio fresco ma spesso la loro bassa concentrazione non consente l’instaurarsi di un buon processo fermentativo e questo compromette la qualità del prodotto finale. Per questo motivo vengono molto spesso impiegati delle colture starter di LAB (inoculi) per migliorare il processo fermentativo e ottenere con più margine di sicurezza la fermentazione desiderata. In questo studio si è valutato l’impiego di due diverse colture starter di LAB, uno costituito da batteri lattici Eterofermentanti obbligati (Lactobacillus buchneri, KWS LACTOSTABILITY) e l’altro costituito da una miscela di batteri lattici Omofermentanti (KWS LACTOQUALITY). Ciascun inoculo è stato addizionato a tre trinciati di frumento o frumento misto avena raccolti in tre diverse Aziende agricole del Veneto; ogni trinciato è stato diviso in tre uguali frazioni a cui è stato aggiunto uno dei due inoculi oppure acqua (controllo). Diverse aliquote di ciascun trinciato sono state sottoposte ad insilamento per un tempo di 6 giorni (T6) mentre altre sono state insilate per un tempo di 60 giorni (T60). L’obiettivo di questa tesi è stato valutare in che modo i due diversi starter influissero sullo sviluppo delle comunità microbiche durante il processo fermentativo e come queste influenzassero la qualità del prodotto finale (pH). Accanto a questo si è valutata la possibile influenza del contenuto di sostanza secca (DM) del trinciato fresco, sull'evoluzione della fermentazione e della comunità microbica. A tale scopo sono stati impiegati due diversi approcci: coltura-dipendente e coltura-indipendente. Nel primo caso sono stati utilizzati terreni specifici per l’isolamento e la conta su piastra di tre target specifici: Batteri Lattici, Carica mesofila totale (CMT) e Muffe e Lieviti; le colonie tipiche di batteri lattici, muffe e lieviti sono state isolate, amplificate tramite PCR e sottoposte a sequenziamento Sanger del gene 16S rRNA/ ITS 1 e ITS 2 per l’identificazione di specie. Con l’approccio di Metabarcoding si è analizzata una porzione dello stesso gene 16S rRNA e sequenziato mediante piattaforma Illumina® Miseq 2x300 al fine di studiare e caratterizzare l’evoluzione delle comunità microbiche dall’inizio alla fine del processo di fermentazione. Tra i principali effetti derivanti dall’impiego di colture starter rilevati in questo in questo studio vi è come l’impiego dei due inoculi abbia favorito la competizione dei LAB rispetto alla flora anaerobia autoctona. Lo starter eterofermentante ha determinato un incremento significativo dei LAB al termine della fermentazione rispetto al controllo e allo starter omofermentante. Quest’ultimo ha però consentito una maggiore acidificazione (pH< 4,01) degli insilati al termine dei 60 giorni e i bassi valori di pH sono correlati ad una maggiore qualità e conservabilità del prodotto. I diversi livelli di sostanza secca (DM) dei campioni hanno influenzato l’evoluzione della comunità microbica al termine della fermentazione e livelli elevati di DM (43.4%) sembrano favorire maggiormente la persistenza dei LAB eterofermentanti al termine della fermentazione.