Integrazione genomica di marcatori fluorescenti per il monitoraggio di ceppi enologici del lievito Saccharomyces cerevisiae

The yeast Saccharomyces cerevisiae is a microorganism widely used by humans both in research, as a model organism, but also in food, where it is used in the preparation of fermented foods and beverages, including wine. Therefore, it is important to have tools to monitor the population dynamics of one or more yeast strains during alcoholic fermentation. Currently, the most widely used techniques are DNA fingerprinting techniques, which allow strains to be differentiated by evaluating different polymorphisms, but these are in vitro systems, requiring cell disruption and DNA extraction. So, there is a need for the development of a faster and more rapid system through the use of fluorescent markers, which allows for the in vivo detection of S. cerevisiae. In this Thesis work, fluorescent markers were integrated at the genomic level through the CRISPR/Cas9 technique into enological yeast strains. Specifically, the sequence expressing red fluorescent protein (mKate) and green fluorescent protein (GFP) were integrated in strain BARCO09 and PR82, respectively. Initially, the two strains were modified by inserting a single copy of the sequences expressing the fluorescent markers, but since biochemical and microscopy analyses indicated low expression levels, a second integration of the two markers into the yeast genome was performed. The experimental results obtained from the two-copy genomic integration confirmed the proper integration and function of the fluorescent markers within the yeast S. cerevisiae. The actual ability to identify and quantify yeast during fermentation will need to be verified with subsequent analyses.

Il lievito Saccharomyces cerevisiae è un microorganismo molto utilizzato dall’uomo sia in ambito di ricerca, come organismo modello, ma anche in ambito alimentare, dove viene utilizzato per la preparazione di cibi e bevande fermentate, tra cui il vino. È perciò importante disporre di strumenti che permettano di monitorare la dinamica di popolazione di uno o più ceppi di lievito durante la fermentazione alcolica. Attualmente le tecniche maggiormente utilizzate sono tecniche di DNA fingerprinting, che permettono di differenziare i ceppi valutando i differenti polimorfismi, ma si tratta di sistemi in vitro, che richiedono la rottura delle cellule e l’estrazione del DNA. È quindi necessario lo sviluppo di un sistema più rapido e veloce attraverso l’utilizzo di marcatori fluorescenti, che permetta la rilevazione in vivo di S. cerevisiae. In questo lavoro di Tesi sono quindi state integrate a livello genomico mediante la tecnica CRISPR/Cas9 dei marcatori fluorescenti in ceppi enologici di lievito. In particolare, è stata integrata la sequenza esprimente la proteina fluorescente rossa (mKate) nel ceppo BARCO09 e la proteina fluorescente verde (GFP) nel ceppo PR82. Inizialmente i due ceppi sono stati modificati inserendo una singola copia delle sequenze esprimenti i marcatori fluorescenti, ma poiché le analisi biochimiche e di microscopia hanno indicato bassi livelli di espressione, è stata effettuata una seconda integrazione dei due marcatori nel genoma dei lieviti. I risultati sperimentali ottenuti dall’integrazione genomica in due copie hanno confermato la corretta integrazione e il funzionamento dei marcatori fluorescenti all’interno del lievito S. cerevisiae. L’effettiva capacità di identificare e quantificare i lieviti durante la fermentazione dovrà essere verificata con successive analisi.