Development of an advanced therapy medicinal product for the treatment of limbal stem cell deficiency in EEC patients

EEC syndrome is caused by heterozygous missense point mutations in the p63 transcription factor’s DNA binding domain. This important gene is expressed by limbal epithelial stem cells (LESCs), and it is turned off in their transient amplifying and differentiated cell. In particular, p63 expression is required to allow corneal epithelium regeneration and the LESCs’ proliferative status maintenance. The p63 gene mutation causes the limbal stem cell deficiency (LESCD), that turns into a progressive keratopathy, formation of a dense vascularised corneal pannus and leading to progressive corneal clouding and eventually visual impairment. No resolutive cures are available to treat the ocular impairments in EEC patients, and the current available therapies are just aimed at alleviate symptoms. A cell therapy approach is not available for these patients. Is not possible to obtain autologous cells from the patients because of the LESCD, and even is this was possible, these cells should be corrected with a gene therapy. On the other hand, a molecular-based therapeutic approach is under investigation: the group led by Prof. Di Iorio identified some powerful small interfering RNAs (siRNAs) against the R279H-p63 mutant allele, one of the most common mutations found in EEC patients. These siRNAs are able to specifically downregulate the R279H-p63 allele expression without affecting the wild-type one. The final aim of the project is to develop therapeutically effective molecular eye drops as a tool to deliver the specific siRNAs for the treatment of young EEC patients carrying the R279H mutation in order to improve their visual acuity. Previously, a commercially available hyaluronic acid-based eye drop formulation (iCross, Offhealth SPA) was tested for the delivery of therapeutic molecules, but it was proved to interfere with the delivery of siRNAs. New eye drop formulations devoid of hyaluronic acid and characterized by high viscosity have been identified (i.e. eye-DRO, Alchimia srl). To confirm their therapeutic efficacy, preliminary transfection assays have been performed, in order to verify the delivery of therapeutic siRNA. For these experiments, immortalized human keratinocyte cell line (HaCaT cells), as well as limbal and oral mucosa epithelial stem cells were used, to test different siRNAs formulations and transfection agents together with the new eye drops. The siGLO RED (Dharmacon) was used as transfection indicator. The results showed that eye-DRO is not suitable for this purpose, since it interferes with the transfection process and significantly reduce the siGLO RED delivery into the cells. Consequently, other potentially effective eyedrops were tested: Systane Ultra (Alcon) and Cationorm (Santen) showed to be appropriate to sustain the delivery of therapeutic siRNAs. At the same time, eye drops toxicity test on human corneal tissues have been carried out, by means of the new Superfusion Apparatus (SA), a device that allows the ex-vivo organotypic culture of human corneal tissues. Both new eye drops showed epithelial toxicity on human corneas at the tested conditions. In the meanwhile, the identification of a transfection reagent alternative to the Lipofectamine 2000 was carried on, but none of tested the transfection agents showed to be effective so far. The next goals of this study will be: Identification of a new suitable and non-toxic transfection agent as well as new eye drops, able to allow the delivery of therapeutic siRNA without inducing corneal toxicity; Evaluation of the delivery of Molecular Eye Drops by using innovative methods with the support of clinical devices (lenses, nano needles, etc.)

La sindrome EEC è causata da mutazioni puntiformi in eterozigosi che colpiscono il dominio di legame al DNA del fattore di trascrizione p63. Questo gene è espresso nelle cellule staminali epiteliali del limbus corneale, ed è spento nelle cellule differenziate. In particolare, l’espressione di p63 è necessaria per permettere la rigenerazione dell’epitelio corneale ed il mantenimento del potenziale proliferativo delle cellule staminali. La mutazione del gene p63 causa il deficit di cellule staminali epiteliali; questo si traduce in una cheratopatia progressiva, che causa la formazione di un pannus sulla superficie della cornea, con presenza di vasi sanguigni, portando a cecità. Non ci sono cure definitive per il trattamento dei difetti oculari nei pazienti EEC, e le terapie disponibili hanno il solo scopo di alleviare i sintomi. Un approccio di terapia cellulare non è applicabile a questi pazienti. Non si possono ottenere cellule staminali autologhe da un paziente a causa del deficit di cellule staminali e, in ogni caso, queste cellule dovrebbero essere corrette mediante terapia genica. D'altra parte, un approccio terapeutico molecolare è in fase di studio: il gruppo di ricerca guidato dal prof. Di Iorio ha identificato alcune molecole di siRNA (small interfering RNAs) contro l’allele mutato R279H-p63, una delle mutazioni più comuni nei pazienti EEC. Questi siRNA sono in grado di silenziare specificamente l’espressione dell’allele R279H-p63 senza avere effetti sull’alleale normale. L’obiettivo finale del progetto è sviluppare un collirio molecolare terapeutico per veicolare le molecole di siRNA nelle cellule corneali dei giovani pazienti affetti da sindrome EEC con mutazione R279H, per migliorarne la capacità visiva. In precedenza, è stato testato un collirio a base di acido ialuronico, iCross (Offhealth SPA), che però interferiva con il trasporto della molecola di siRNA. Successivamente, è stato identificato un collirio non contenente acido ialuronico ad alta viscosità (eye-DRO, Alchimia srl), che potrebbe risultare adatto per il trasporto delle molecole di siRNA. Per confermare questa ipotesi, dovrà essere verificata l’efficacia del nuovo collirio. Sono stati eseguiti test di trasfezione preliminari per determinare l’effetto del nuovo collirio nel processo di trasfezione e, di conseguenza, nel trasporto del siRNA terapeutico. Per questi esperimenti, sono state usate una linea cellulare immortalizzata di cheratinociti umani (cellule HaCaT), cellule staminali limbari e della mucosa orale, per testare diverse formulazioni di siRNA e agenti di trasfezione, contemporaneamente al collirio. Il siGLO RED (Dharmacon) è stato usato come indicatore di trasfezione. I risultati hanno mostrato che l’eye-DRO interferisce con il processo di trasfezione e diminuisce significativamente il trasporto del siGLO RED nelle cellule. Di conseguenza, sono stati testati altri colliri disponibili in commercio: Systane Ultra (Alcon) e Cationorm (Santen), che si sono dimostrati adatti a consentire il trasporto del siRNA terapeutico. In parallelo, è stato effettuato un test di tossicità dei colliri su tessuti corneali umani, per mezzo del nuovo Superfusion Apparatus (SA), un dispositivo che permette l’allestimento ed il mantenimento di colture organotipiche ex-vivo di tessuti corneali umani. Entrambi i nuovi colliri, tuttavia, hanno indotto, alle condizioni testate, tossicità epiteliale su cornee. Contemporaneamente, è stata portata avanti l’individuazione di un agente di trasfezione alternativo alla Lipofectamina 2000, ma nessuno degli agenti di trasfezione finora testati ha mostrato di essere altrettanto efficace.