Calmodulin (CaM) is a Ca2+ ion-sensitive protein involved in numerous cell signaling processes. Since it has already been extensively studied, a variety of information is available regarding its structure and function; therefore, it can be used as a model protein for structural studies by electron spin resonance (EPR) spectroscopy. The main objective of this project is to observe what conformational changes CaM undergoes as it goes from a buffer solution environment to a cell-mimetic environment such as that of eukaryotic cell extract, while verifying that the paramagnetic probes chosen were suitable for conducting the investigation. To accomplish this study, EPR spectroscopy was used, in continuous wave and pulsed dipolar mode. For this purpose, a number of CaM mutants were purified, whose purposefully chosen mutation sites enabled its labeling (Site-Directed Spin Labeling) with two separate nitroxide paramagnetic probes. A target peptide (M13) of CaM, in the presence of which it undergoes a major conformational change, was then synthesized. The latter was labeled with a triplet porphyrin probe, with a view to distance measurements by dipolar pulsed EPR techniques coupled to photoexcitation. Taking advantage of the inserted paramagnetic probes, continuous wave EPR measurements were made, comparing the results in buffer solution with those in a reducing environment. This made it possible to verify the conformational changes of the protein in the presence of Ca2+and/or the M13 peptide, as well as to determine the rate of reduction of the paramagnetic probe in a reducing environment. By means of pulsed dipolar EPR spectroscopy, further information on the conformational changes of CaM was obtained from the interspin distances obtained from the measurements. To explore the different conformations assumed by the protein, different experimental conditions were used, including some in buffer solution with the presence or absence of certain cofactors (Ca2+, M13), compared with those performed in eukaryotic cell extract. Thanks to EPR spectroscopy therefore, in addition to studying conformational changes in the protein, the strength of a given spin label in a cell-mimetic environment could be assessed, paving the way for its possible use in the cell, i.e., the native environment of the protein itself. Marking the peptide with the porphyrin chromophore, moreover, will make it possible to exploit the sensitivity advantages given by the triplet probe when measuring protein-peptide distances, which may serve as a complement to the protein-protein distances obtained in this thesis. Thus, the intention is to concretize these goals within future projects that can follow up on the studies addressed in this thesis project.

La calmodulina (CaM) è una proteina sensibile agli ioni Ca2+, coinvolta in numerosi processi di segnalazione cellulare. Essendo già stata molto studiata, sono disponibili svariate informazioni riguardo la sua struttura e funzione; pertanto, può essere utilizzata come proteina modello per studi strutturali mediante spettroscopia di risonanza di spin elettronico (EPR). L’obbiettivo principale di questo progetto è osservare a quali variazioni conformazionali viene sottoposta la CaM, passando da un ambiente in soluzione tampone a un ambiente cellula-mimetico come quello dell’estratto cellulare eucariotico, verificando nel contempo che le sonde paramagnetiche scelte risultassero adatte per condurre l’indagine. Per compiere questo studio si è fatto uso della spettroscopia EPR, in modalità onda continua e dipolare impulsata. A tal fine sono stati purificati alcuni mutanti della CaM, i cui siti di mutazione, scelti in maniera mirata, hanno consentito la sua marcatura (Site-Directed Spin Labeling) con due sonde paramagnetiche al nitrossido distinte. Si è poi sintetizzato un peptide bersaglio (M13) della CaM, in presenza del quale essa va incontro a un importante cambio conformazionale. Quest’ultimo è stato marcato con una sonda porfirinica di tripletto, in prospettiva di misure di distanza mediante tecniche EPR impulsate dipolari accoppiate a fotoeccitazione. Sfruttando le sonde paramagnetiche inserite, si sono effettuate misure EPR in onda continua, comparando i risultati in soluzione tampone con quelli in ambiente riducente. In questo modo è stato possibile verificare le variazioni conformazionali della proteina in presenza di Ca2+e/o del peptide M13, oltre a determinare la velocità di riduzione della sonda paramagnetica in ambiente riducente. Tramite spettroscopia EPR dipolare impulsata si sono ottenute ulteriori informazioni sulle variazioni conformazionali della CaM, grazie alle distanze interspin ricavate dalle misure effettuate. Per esplorare le diverse conformazioni assunte dalla proteina si sono utilizzate differenti condizioni sperimentali, di cui alcune in soluzione tampone con la presenza o meno di determinati cofattori (Ca2+, M13), comparate con quelle effettuate in estratto cellulare eucariotico. Grazie alla spettroscopia EPR quindi, oltre a studiare le variazioni conformazionali della proteina, si è potuta valutare la resistenza di un determinato spin label in un ambiente cellula-mimetico, aprendo la strada al suo possibile utilizzo in cellula, ovvero l’ambiente nativo della proteina stessa. La marcatura del peptide con il cromoforo porfirina, inoltre, consentirà di sfruttare i vantaggi di sensibilità dati dalla sonda di tripletto durante la misura di distanze proteina-peptide, che potranno fungere da complemento alle distanze proteina-proteina ottenute in questa tesi. L’intenzione è dunque quella di concretizzare questi obbiettivi all’interno di progetti futuri, che possano dare un seguito agli studi affrontati nel corso di questo progetto di tesi.

La calmodulina come proteina modello per indagini strutturali mediante spettroscopia EPR

TOSO, CLAUDIA
2021/2022

Abstract

Calmodulin (CaM) is a Ca2+ ion-sensitive protein involved in numerous cell signaling processes. Since it has already been extensively studied, a variety of information is available regarding its structure and function; therefore, it can be used as a model protein for structural studies by electron spin resonance (EPR) spectroscopy. The main objective of this project is to observe what conformational changes CaM undergoes as it goes from a buffer solution environment to a cell-mimetic environment such as that of eukaryotic cell extract, while verifying that the paramagnetic probes chosen were suitable for conducting the investigation. To accomplish this study, EPR spectroscopy was used, in continuous wave and pulsed dipolar mode. For this purpose, a number of CaM mutants were purified, whose purposefully chosen mutation sites enabled its labeling (Site-Directed Spin Labeling) with two separate nitroxide paramagnetic probes. A target peptide (M13) of CaM, in the presence of which it undergoes a major conformational change, was then synthesized. The latter was labeled with a triplet porphyrin probe, with a view to distance measurements by dipolar pulsed EPR techniques coupled to photoexcitation. Taking advantage of the inserted paramagnetic probes, continuous wave EPR measurements were made, comparing the results in buffer solution with those in a reducing environment. This made it possible to verify the conformational changes of the protein in the presence of Ca2+and/or the M13 peptide, as well as to determine the rate of reduction of the paramagnetic probe in a reducing environment. By means of pulsed dipolar EPR spectroscopy, further information on the conformational changes of CaM was obtained from the interspin distances obtained from the measurements. To explore the different conformations assumed by the protein, different experimental conditions were used, including some in buffer solution with the presence or absence of certain cofactors (Ca2+, M13), compared with those performed in eukaryotic cell extract. Thanks to EPR spectroscopy therefore, in addition to studying conformational changes in the protein, the strength of a given spin label in a cell-mimetic environment could be assessed, paving the way for its possible use in the cell, i.e., the native environment of the protein itself. Marking the peptide with the porphyrin chromophore, moreover, will make it possible to exploit the sensitivity advantages given by the triplet probe when measuring protein-peptide distances, which may serve as a complement to the protein-protein distances obtained in this thesis. Thus, the intention is to concretize these goals within future projects that can follow up on the studies addressed in this thesis project.
2021
Calmodulin as a model protein for structural investigations by EPR spectroscopy
La calmodulina (CaM) è una proteina sensibile agli ioni Ca2+, coinvolta in numerosi processi di segnalazione cellulare. Essendo già stata molto studiata, sono disponibili svariate informazioni riguardo la sua struttura e funzione; pertanto, può essere utilizzata come proteina modello per studi strutturali mediante spettroscopia di risonanza di spin elettronico (EPR). L’obbiettivo principale di questo progetto è osservare a quali variazioni conformazionali viene sottoposta la CaM, passando da un ambiente in soluzione tampone a un ambiente cellula-mimetico come quello dell’estratto cellulare eucariotico, verificando nel contempo che le sonde paramagnetiche scelte risultassero adatte per condurre l’indagine. Per compiere questo studio si è fatto uso della spettroscopia EPR, in modalità onda continua e dipolare impulsata. A tal fine sono stati purificati alcuni mutanti della CaM, i cui siti di mutazione, scelti in maniera mirata, hanno consentito la sua marcatura (Site-Directed Spin Labeling) con due sonde paramagnetiche al nitrossido distinte. Si è poi sintetizzato un peptide bersaglio (M13) della CaM, in presenza del quale essa va incontro a un importante cambio conformazionale. Quest’ultimo è stato marcato con una sonda porfirinica di tripletto, in prospettiva di misure di distanza mediante tecniche EPR impulsate dipolari accoppiate a fotoeccitazione. Sfruttando le sonde paramagnetiche inserite, si sono effettuate misure EPR in onda continua, comparando i risultati in soluzione tampone con quelli in ambiente riducente. In questo modo è stato possibile verificare le variazioni conformazionali della proteina in presenza di Ca2+e/o del peptide M13, oltre a determinare la velocità di riduzione della sonda paramagnetica in ambiente riducente. Tramite spettroscopia EPR dipolare impulsata si sono ottenute ulteriori informazioni sulle variazioni conformazionali della CaM, grazie alle distanze interspin ricavate dalle misure effettuate. Per esplorare le diverse conformazioni assunte dalla proteina si sono utilizzate differenti condizioni sperimentali, di cui alcune in soluzione tampone con la presenza o meno di determinati cofattori (Ca2+, M13), comparate con quelle effettuate in estratto cellulare eucariotico. Grazie alla spettroscopia EPR quindi, oltre a studiare le variazioni conformazionali della proteina, si è potuta valutare la resistenza di un determinato spin label in un ambiente cellula-mimetico, aprendo la strada al suo possibile utilizzo in cellula, ovvero l’ambiente nativo della proteina stessa. La marcatura del peptide con il cromoforo porfirina, inoltre, consentirà di sfruttare i vantaggi di sensibilità dati dalla sonda di tripletto durante la misura di distanze proteina-peptide, che potranno fungere da complemento alle distanze proteina-proteina ottenute in questa tesi. L’intenzione è dunque quella di concretizzare questi obbiettivi all’interno di progetti futuri, che possano dare un seguito agli studi affrontati nel corso di questo progetto di tesi.
calmodulina
EPR
spin labeling
studi strutturali
spin labels
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