Determinazione e caratterizzazione dei peptidi e dei polisaccaridi escreti da Saccharomyces cerevisiae durante la fermentazione e la post-fermentazione in un sistema modello.

The aim of this thesis is to quantify and characterize the polysaccharides and peptides excreted by Saccharomyces cerevisiae in wine during the fermentation and post-fermentation periods. Actually, some studies have shown the central role of yeast in improving both the stability and qualitative characteristics of the wine, and this fact can be ascribed to the activity of the peptides and polysaccharides released by the yeast cell. For the wine industry, this has led to the increase in the sale of preparations containing yeast derivatives or enzymes which accelerate the autolysis process and the release of these substances, but the compounds and the mechanisms involved in these occurrences are not completely known. With the aim of deepening the current knowledge on this topic, a commercial strain of Saccharomyces cerevisiae was inoculated into a model system, which was stored at the same temperatures of the winemaking process. Sampling was performed at 0, 7, 14, 30, 60, 90 and 120 days after inoculation. By monitoring the weight of the model wine and analyzing the sugar, acid and ethanol contents, the end of fermentation was identified seven days after inoculation. From the HPLC analysis of the samples it was shown that the release of polysaccharides occurs in constant quantities after the end of the fermentation up to one month of ageing, but their quantity increases up to three months and finally decreases at four months, due to a decline in low molecular weight polysaccharides. A colorimetric assay and HPLC analysis of the ultrafiltered samples were used for the detection of peptides. The results showed different concentrations during the time, but the same release trend: an increase after the end of fermentation until a plateau was reached. The anti-oxidant activity of the peptides was measured by the FRAP assay, showing an opposite trend compared to that of the release of peptides. However, glutathione analysis demonstrated that the assay does not show any anti-oxidant activity associated with the compound, indicating that this method is not suitable for the analysis of anti-oxidant peptides. Therefore, alternative methods such as ORAC-fluorescein, DPPH and ABTS assays, already used by some authors mentioned in this thesis, should be applied to detect the possible anti-oxidant activity of the yeast peptides. Further information will be obtained from the analysis of the samples by mass spectrometry, which will allow to clearly identify their aminoacid sequences.

L’obiettivo di questa tesi è quello di quantificare e caratterizzare i polisaccaridi e i peptidi escreti da Saccharomyces cerevisiae nel vino durante il periodo fermentativo e post-fermentativo. Da alcuni studi è emersa infatti la centralità del lievito nel migliorare la stabilità e le caratteristiche qualitative della bevanda, fenomeno che potrebbe avvenire attraverso il rilascio di peptidi bioattivi e di polisaccaridi derivanti dalla parete cellulare. Ciò ha portato all’aumento della vendita di preparati per l’industria enologica contenenti derivati del lievito o enzimi con lo scopo di accelerare il processo di autolisi e il rilascio di queste sostanze, senza però sapere nello specifico con quali composti e attraverso quali meccanismi si ottenga il risultato atteso. Con lo scopo di approfondire le conoscenze su questo tema, un ceppo commerciale di Saccharomyces cerevisiae è stato inoculato in un sistema modello, che è stato conservato a temperature che rispecchiano quelle del reale processo di vinificazione. È stato effettuato un campionamento a 0, 7, 14, 30, 60, 90 e 120 giorni dall’inoculo. Monitorando il peso del vino modello e analizzando zuccheri, acidi ed etanolo presenti, è stato individuato il termine della fermentazione, che si è verificato a sette giorni dall’inoculo. Dall’analisi in HPLC dei campioni è emerso che il rilascio di polisaccaridi avviene in quantità costanti dopo la fine della fermentazione fino a un mese, la loro quantità aumenta fino a tre mesi e infine diminuisce a quattro mesi. La diminuzione del contenuto in polisaccaridi che si registra a quattro mesi è riconducibile a un calo dei polisaccaridi a basso peso molecolare. Il saggio colorimetrico e l’analisi in HPLC dei campioni ultrafiltrati per la rilevazione dei peptidi hanno restituito concentrazioni diverse, ma lo stesso trend di rilascio, ovvero un aumento dopo la fine della fermentazione fino al raggiungimento di un plateau. Il saggio per l’attività antiossidante (FRAP) dei peptidi condotto sui campioni ultrafiltrati non ha restituito i risultati attesi, in quanto si assiste ad un andamento opposto a quello del rilascio di peptidi. Analizzando il glutatione è emerso che il saggio non individua alcuna attività antiossidante associata al composto: ciò conferma che il metodo non è adatto all’analisi dei peptidi antiossidanti eventualmente presenti. Analisi future alternative al saggio utilizzato potrebbero essere i saggi ORAC-fluoresceina, DPPH e ABTS, già impiegati da alcuni autori citati in questa tesi. Ulteriori informazioni saranno ricavate dall’analisi dei campioni per spettrometria di massa, che consentirà di identificare i composti peptidici rilasciati, di cui si potranno identificare le sequenze.