Characterization of wild-type and folding-defective mutants of galactosylceramidase (GALC)

In the process of protein synthesis, almost 40% of the total polypeptide chains are translocated into the endoplasmic reticulum (ER), where they begin their maturation process. The ER has a very refined and complex system of quality control, ensuring that only properly folded proteins can continue their journey through the Golgi apparatus, from where they are sent to their final destinations. Meanwhile, misfolded proteins that fail to acquire their native structure are retained into the ER, where they are sent to degradation through ER-associated degradation (ERAD) or ER-to-lysosome-associated degradation (ERLAD). Galactosylceramidase (GALC) is a lysosomal hydrolase responsible for sphingolipids metabolism, essential for the maintenance of the myelin sheath along nerves. Mutations along the coding sequence of this protein are responsible for folding-defective variants, which accumulate inside the ER causing toxicity and cell death in the central nervous system (CNS). The inability of GALC to effectively participate in the sphingolipids metabolism leads to a lysosomal storage disorder (LSD) called Krabbe disease. Patients affected by this disease present severe damage at the level of their CNS, caused by cell death for toxic accumulation of metabolic intermediates and for the absence of myelin along the nervous system. In this work we study the wild-type form of GALC and four of its mutants, trying to find a proper readout to assess if the enzyme is being correctly folded or not. Our results show that properly folded GALC completes its maturation process and it is secreted outside the cell, while folding-incompetent variants are not secreted, as they are retained inside the ER.

Nel processo di sintesi proteica, quasi il 40% delle catene polipeptidiche totali viene traslocato nel reticolo endoplasmatico (RE), dove inizia il processo di maturazione. Il RE dispone di un sistema di controllo della qualità molto raffinato e complesso, che garantisce che solo le proteine correttamente ripiegate possano continuare il loro viaggio attraverso l'apparato di Golgi, da dove vengono inviate alle loro destinazioni finali. Nel frattempo, le proteine mal ripiegate che non riescono ad acquisire la loro struttura nativa vengono trattenute nel RE, dove vengono avviate alla degradazione attraverso la degradazione associata al RE (ERAD) o la degradazione associata dal RE al lisosoma (ERLAD). La galattosilceramidasi (GALC) è un'idrolasi lisosomiale responsabile del metabolismo degli sfingolipidi, essenziale per il mantenimento della guaina mielinica lungo i nervi. Le mutazioni lungo la sequenza codificante di questa proteina sono responsabili di varianti con difetti di ripiegamento, che si accumulano all'interno del RE causando tossicità e morte cellulare nel sistema nervoso centrale (SNC). L'incapacità di GALC di partecipare efficacemente al metabolismo degli sfingolipidi porta a un disturbo da accumulo lisosomiale (LSD) chiamato malattia di Krabbe. I pazienti affetti da questa malattia presentano gravi danni a livello del SNC, causati dalla morte cellulare per accumulo tossico di intermedi metabolici e per l'assenza di mielina lungo il sistema nervoso. In questo lavoro studiamo la forma wild-type di GALC e quattro suoi mutanti, cercando di trovare una lettura adeguata per valutare se l'enzima è ripiegato correttamente o meno. I nostri risultati mostrano che GALC correttamente ripiegato completa il suo processo di maturazione e viene secreto all'esterno della cellula, mentre le varianti incompetenti per il ripiegamento non vengono secrete, poiché vengono trattenute all'interno del RE.