The growth of a tumor depends on its ability to shape the tumor immune microenvironment (TME) into an immunosuppressive milieu to block the host immunity. In glioblastoma (GBM), a primary central nervous system (CNS) tumor, this characteristic is remarkably pronounced and is associated with the lack or paucity of tumor T cell infiltration, characterizing the so-called “cold tumors”. Recent studies performed in our laboratory revealed the presence of a high number of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) in the TME of GBM patients. In addition, the same studies showed that BMDMs are endowed with a strong immune suppressive activity and with a sustained iron-recycling phenotype compared to the resident microglial cells present in the same tumor areas. On the basis of these results, subsequent studies have been carried out to evaluate the role of iron-metabolism in the immunosuppressive activity of myeloid cells focusing on heme oxygenase-1 (HO-1), which is the rate-limiting enzyme involved in the oxidative catabolism of heme and that orchestrates the immunosuppressive activity of macrophages. In particular, this thesis project represents a further investigation regarding the correlation between the immunosuppressive activity exerted by macrophages and the expression of interleukin-10 (IL-10), which is an anti-inflammatory cytokine presumably linked to the HO-1 pathway. To this aim we used an in vitro model of immunosuppressive macrophages derived from blood monocytes, which were co-cultured with lymphocytes in order to evaluate the modulation of IL-10 expression in the interplay between these two cell types. Moreover, to confirm the involvement of HO-1 in IL-10 modulation, we carried out a pharmacological treatment based on the use of zinc protoporphyrin IX (ZnPPIX), a HO-1 inhibitor. The results showed that macrophages release IL-10, but also that activated T cells following interaction with macrophages increase significantly IL-10 release, that is reduced significantly by HO-1 inhibition. We further explored if immune suppression is mediated by cell contact or also by soluble factors and which is the potential pathway involved in the release of IL-10. Overall, the results showed that macrophage-mediated immune suppression depends on the crosstalk with activated T cells and that this mechanism is mediated by both cell contact and soluble mediators. However, even though an increased Programmed cell Death protein (PD-1) expression was observed on T cells upon contact with macrophages, PD-1 did not seem to be involved in IL-10 release.

Durante la crescita di un tumore il microambiente tumorale (TME) molto spesso presenta un infiltrato immunitario caratterizzato da un’attività immunosoppressoria che favorisce la crescita del tumore. Nel caso del glioblastoma (GBM), un tumore primitivo del sistema nervoso centrale (SNC), questa caratteristica è notevolmente pronunciata ed è associata ad una scarsa o assente presenza di linfociti anti-tumorali. In questo contesto, studi recenti condotti nel nostro laboratorio hanno rilevato un'elevata infiltrazione nel tumore di macrofagi derivanti dal midollo osseo (BMDM) in campioni raccolti da pazienti con GBM. È stato osservato che tali cellule sono dotate di una forte attività immunosoppressiva e presentano un metabolismo del ferro accentuato rispetto alle altre popolazioni presenti nel TME. Sulla base di questi risultati, successivi studi sono stati condotti per valutare il ruolo del metabolismo del ferro nell'attività immunosoppressiva delle cellule mieloidi, con particolare riferimento su eme ossigenasi-1 (HO-1), l'enzima limitante nel catabolismo ossidativo dell'eme che, sulla base di nostri studi precedenti, orchestra l’attività immunosoppressiva dei macrofagi. In particolare, questo progetto di tesi ha indagato la correlazione tra l'attività immunosoppressiva esercitata dalle BMDM e l'espressione di IL-10, un’importante citochina anti-infiammatoria. A tal fine, abbiamo utilizzato un modello in vitro di macrofagi immunosoppressivi messi in co-coltura con linfociti attivati al fine di valutare la modulazione dell'espressione di IL-10 in entrambe le popolazioni cellulari a contatto. Inoltre, per confermare il coinvolgimento di HO-1 nella modulazione di IL-10, abbiamo seguito un approccio farmacologico basato sull’utilizzo di un inibitore, la zinco protoporfirina IX (ZnPPIX). I risultati hanno dimostrato che IL-10 viene rilasciata non solo dai macrofagi soppressori, ma anche da parte dei linfociti T attivati in seguito a contatto con i macrofagi. Una riduzione del rilascio di IL-10 è stata osservata sia da parte dei macrofagi che delle cellule T in seguito al trattamento con ZnPPIX. Inoltre, abbiamo esaminato se l’immunosoppressione è mediate dal contatto cellulare o anche da fattori solubili e quale sia il potenziale pathway coinvolto nel rilascio di IL-10. Nel complesso, i risultati hanno dimostrato che l’immunosoppressione mediata dai macrofagi dipende dal crosstalk con le cellule T attivate ed è mediata sia dal contatto cellulare che da mediatori solubili. Tuttavia, anche se è stata osservata un’aumentata espressione della proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1 sulle cellule T al contatto con i macrofagi, PD-1 non sembra essere coinvolto nel rilascio di IL-10.

The role of iron metabolism in the immunosuppressive activity of myeloid cells into the tumor microenvironment

MOLVETTI, MARIA GRAZIA
2021/2022

Abstract

The growth of a tumor depends on its ability to shape the tumor immune microenvironment (TME) into an immunosuppressive milieu to block the host immunity. In glioblastoma (GBM), a primary central nervous system (CNS) tumor, this characteristic is remarkably pronounced and is associated with the lack or paucity of tumor T cell infiltration, characterizing the so-called “cold tumors”. Recent studies performed in our laboratory revealed the presence of a high number of bone marrow-derived macrophages (BMDMs) in the TME of GBM patients. In addition, the same studies showed that BMDMs are endowed with a strong immune suppressive activity and with a sustained iron-recycling phenotype compared to the resident microglial cells present in the same tumor areas. On the basis of these results, subsequent studies have been carried out to evaluate the role of iron-metabolism in the immunosuppressive activity of myeloid cells focusing on heme oxygenase-1 (HO-1), which is the rate-limiting enzyme involved in the oxidative catabolism of heme and that orchestrates the immunosuppressive activity of macrophages. In particular, this thesis project represents a further investigation regarding the correlation between the immunosuppressive activity exerted by macrophages and the expression of interleukin-10 (IL-10), which is an anti-inflammatory cytokine presumably linked to the HO-1 pathway. To this aim we used an in vitro model of immunosuppressive macrophages derived from blood monocytes, which were co-cultured with lymphocytes in order to evaluate the modulation of IL-10 expression in the interplay between these two cell types. Moreover, to confirm the involvement of HO-1 in IL-10 modulation, we carried out a pharmacological treatment based on the use of zinc protoporphyrin IX (ZnPPIX), a HO-1 inhibitor. The results showed that macrophages release IL-10, but also that activated T cells following interaction with macrophages increase significantly IL-10 release, that is reduced significantly by HO-1 inhibition. We further explored if immune suppression is mediated by cell contact or also by soluble factors and which is the potential pathway involved in the release of IL-10. Overall, the results showed that macrophage-mediated immune suppression depends on the crosstalk with activated T cells and that this mechanism is mediated by both cell contact and soluble mediators. However, even though an increased Programmed cell Death protein (PD-1) expression was observed on T cells upon contact with macrophages, PD-1 did not seem to be involved in IL-10 release.
2021
The role of iron metabolism in the immunosuppressive activity of myeloid cells into the tumor microenvironment
Durante la crescita di un tumore il microambiente tumorale (TME) molto spesso presenta un infiltrato immunitario caratterizzato da un’attività immunosoppressoria che favorisce la crescita del tumore. Nel caso del glioblastoma (GBM), un tumore primitivo del sistema nervoso centrale (SNC), questa caratteristica è notevolmente pronunciata ed è associata ad una scarsa o assente presenza di linfociti anti-tumorali. In questo contesto, studi recenti condotti nel nostro laboratorio hanno rilevato un'elevata infiltrazione nel tumore di macrofagi derivanti dal midollo osseo (BMDM) in campioni raccolti da pazienti con GBM. È stato osservato che tali cellule sono dotate di una forte attività immunosoppressiva e presentano un metabolismo del ferro accentuato rispetto alle altre popolazioni presenti nel TME. Sulla base di questi risultati, successivi studi sono stati condotti per valutare il ruolo del metabolismo del ferro nell'attività immunosoppressiva delle cellule mieloidi, con particolare riferimento su eme ossigenasi-1 (HO-1), l'enzima limitante nel catabolismo ossidativo dell'eme che, sulla base di nostri studi precedenti, orchestra l’attività immunosoppressiva dei macrofagi. In particolare, questo progetto di tesi ha indagato la correlazione tra l'attività immunosoppressiva esercitata dalle BMDM e l'espressione di IL-10, un’importante citochina anti-infiammatoria. A tal fine, abbiamo utilizzato un modello in vitro di macrofagi immunosoppressivi messi in co-coltura con linfociti attivati al fine di valutare la modulazione dell'espressione di IL-10 in entrambe le popolazioni cellulari a contatto. Inoltre, per confermare il coinvolgimento di HO-1 nella modulazione di IL-10, abbiamo seguito un approccio farmacologico basato sull’utilizzo di un inibitore, la zinco protoporfirina IX (ZnPPIX). I risultati hanno dimostrato che IL-10 viene rilasciata non solo dai macrofagi soppressori, ma anche da parte dei linfociti T attivati in seguito a contatto con i macrofagi. Una riduzione del rilascio di IL-10 è stata osservata sia da parte dei macrofagi che delle cellule T in seguito al trattamento con ZnPPIX. Inoltre, abbiamo esaminato se l’immunosoppressione è mediate dal contatto cellulare o anche da fattori solubili e quale sia il potenziale pathway coinvolto nel rilascio di IL-10. Nel complesso, i risultati hanno dimostrato che l’immunosoppressione mediata dai macrofagi dipende dal crosstalk con le cellule T attivate ed è mediata sia dal contatto cellulare che da mediatori solubili. Tuttavia, anche se è stata osservata un’aumentata espressione della proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1 sulle cellule T al contatto con i macrofagi, PD-1 non sembra essere coinvolto nel rilascio di IL-10.
heme-oxygenase 1
interleukin 10
iron metabolism
TAMs
TME
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