Production and characterization of a highly stable chimeric miniprotein with inhibitory activity against HIV-1

In the USA, 20% of patients living with HIV-1 infection who are undergoing antiretroviral therapy are suffering from treatment failure. Entry inhibitors represent a useful tool when resistant HIV-1 strains and/or treatment failure arise in patients. Env protein, in particular its gp41 subunit, is the main target of entry inhibitors: Enfuvirtide (formerly T20), the first to be approved for clinical use, is a class-I entry inhibitor binding the NHR region of gp41. In contrast, class-II inhibitors are designed to target CHR region of gp41 subunit: the compounds designed and produced by the research group hosting this thesis are called covNHR. Their latest produced compound, called covNHR-N-dSS, showed an inhibitory potency in the nanomolar range. In this work, the aim is the production and the biophysical characterization of a covNHR-N chimeric miniprotein, containing NTP and MP pockets of NHR binding surface, stabilized by two disulfide bonds and by Q-I mutations in positions 23, 41, 86. The mutated covNHR-N-dSS-Q23I protein was produced and purified before studying its secondary structure features and its behaviour when binding the complementary CHR peptide, Y24L. The characterization, involving Circular Dichroism, Dynamic Light Scattering, Isothermal Titration Calorimetry, and Differential Scanning Calorimetry experiments, allowed to confirm that the strongly stabilizing mutations actually improve the binding with the complementary CHR-derived peptide. These important results need to be complemented by further in vitro inhibition assays to confirm the potency of this construct against HIV-1 strains.

Negli Stati Uniti, il 20% dei pazienti affetti da HIV-1, attualmente in terapia antiretrovirale, accusa un fallimento terapeutico. Gli inibitori di entrata rappresentano uno strumento utile quando insorgono ceppi di HIV-1 resistenti e/o fallimento terapeutico. La proteina Env, in particolare la subunità gp41, è il target principale degli inibitori di entrata: Enfuvirtide (precedentemente T20), il primo ad essere approvato per uso clinico, è un inibitore di entrata di classe I che si lega alla regione NHR della subunità gp41. Contrariamente, gli inibitori di classe II sono progettati per colpire la regione CHR di gp41: i composti ideati e prodotti dal gruppo di ricerca che ha permesso la realizzazione di questa tesi sono chiamati covNHR. L'ultimo composto da loro prodotto, chiamato covNHR-N-dSS, ha dimostrato una potenza inibitoria nell'intervallo nanomolare. Lo scopo di questo lavoro è la produzione e la caratterizzazione biofisica di una miniproteina chimerica covNHR-N, contenente le tasche NTP e MP della superficie di contatto NHR, stabilizzata da due ponti disolfuro e dalle mutazioni Q-I in posizione 23, 41, 86. La proteina mutata covNHR-N-dSS-Q23I è stata prodotta e purificata, prima di studiarne la struttura secondaria e il comportamento quando legata al suo peptide CHR complementare, Y24L. La caratterizzazione, che ha coinvolto esperimenti di dicroismo circolare, diffusione dinamica della luce, calorimetria isotermica di titolazione e calorimetria a scansione differenziale, ha permesso di confermare che le mutazioni fortemente stabilizzanti portano a un miglioramento del legame con il peptide complementare derivato dalla regione CHR. Questi importanti risultati devono essere integrati con ulteriori saggi di inibizione in vitro per confermare la potenza di questo composto contro ceppi di HIV-1.