SINTESI DI CONIUGATI PEPTIDICI PER STUDI DI DELIVERY INTRACELLULARE.

Il lavoro di tesi è stato svolto presso il gruppo di ricerca di Chimica Bio-Organica e fa parte di un progetto più ampio che si svolge in collaborazione con l’Università “Tor Vergata” di Roma. Studi condotti dal gruppo di Roma hanno permesso di individuare alcune sequenze peptidiche in grado di inibire la fosfatasi SHP-2, una proteina coinvolta nel processo di trasduzione del segnale cellulare nel nostro organismo che, quando viene mutata, causa una proliferazione cellulare incontrollata e il conseguente sviluppo di tumori. Tra i molti peptidi studiati è stato individuato il peptide Ac – Leu – Asn – pTyr – Ile – Asp – Leu – Asp – Trp – NH2 (denominato P8-a), quale miglior candidato ad inibire la fosfatasi SHP-2, grazie alla sua elevata affinità per particolari domini della proteina SHP-2. P8-a presenta un residuo di fosfotirosina (pTyr), che favorisce il riconoscimento di tali siti. Scopo di questa tesi è lo studio della reazione di coniugazione tra un analogo di P8-a e un analogo della penetratina (PNT), un cell penetrating peptide (CPP) in grado di traslocare altre molecole all’interno della membrana cellulare. I peptidi presi in esame sono i seguenti P8-a: Ac–Leu–Asn–pTyr–Ile–Asp–Leu–Asp–Trp–NH2 P8-b: Ac–βAla–Leu–Asn–Tyr–Ile–Asp–Leu–Asp–Trp–Ahx–Cys–NH2 P8-c: CF–βAla–Leu–Asn–pTyr–Ile–Asp–Leu–Asp–Trp–Ahx–Cys–NH2 PNT-d : H–Cys-Arg–Gln–Ile–Lys–Ile–Trp–Phe–Gln–Asn–Arg–Arg–nLe–Lys–Trp–Lys–Lys–NH2 Per la coniugazione con il peptide PNT si è scelta la formazione di un ponte disolfuro. Per questo scopo sono stati sintetizzati analoghi di P8-a (P8-b e P8-c) contenenti un residuo di cisteina (Cys) all’estremità C-terminale e un analogo della PNT (PNT-d) contenente la Cys all’estremità N-terminale. Nella parte C-terminale di P8-b e P8-c è stato inserito anche uno spaziatore (l’acido 6-amminoesanoico, Ahx) allo scopo di distanziare le due sequenze peptidiche; un processo analogo è stato fatto nella parte N-terminale inserendo come spaziatore la βAlanina, (βAla). P8-b contiene una Tyr al posto della pTyr perché questo peptide viene utilizzato per il solo scopo di individuare le migliori condizioni di reazione. Invece il peptide P8-c contiene sia la pTyr che una sonda fluorescente, la 5(6) – Carbossifluoresceina (CF), legata alla estremità N-terminale. Tale sonda sarà utile per individuare la presenza del coniugato all’interno delle cellule attraverso misure di fluorescenza. I peptidi sono stati preparati mediante sintesi in fase solida e successivamente purificati attraverso tecniche cromatografiche. Il ponte disolfuro è stato ottenuto per ossidazione in presenza di dimetilsolfossido (DMSO).