Analisi proteomica di cellule knock-out per la glutaredossina 2

La glutaredossina 2 (Grx2) è una proteina coinvolta nella regolazione redox cellulare. La prima glutaredossina fu scoperta in E. coli nel 1976 come elettron-donatore glutatione-dipendente, mentre Grx2, un enzima redox principalmente coinvolto nella glutationilazione/deglutationilazione di proteine, è stata identificata in mammifero nel 2001. Grx2 è in grado di formare dimeri enzimaticamente inattivi tramite la coordinazione di un centro ferro-zolfo di tipo 2Fe-2S. I dimeri sono stabilizzati dal glutatione ridotto (GSH) e destabilizzati da un aumento del glutatione ossidato (GSSG). Grx2 è espressa ubiquitariamente ma risulta particolarmente abbondante laddove lo stress ossidativo è maggiore, come nel cuore e nei muscoli. In questo studio sono stati indagati gli effetti della deficienza di Grx2 sul proteoma di due linee cellulari tumorali umane. Nello specifico, le analisi hanno riguardato le linee cellulari A375 (melanoma) e MDA-MB-436 (tumore mammario). Per la generazione delle cellule knock-out (KO), è stata impiegata la tecnologia CRISPR/Cas9, ed esse sono state confrontate con cellule di controllo wild type (WT) e non-targeting (NT). Queste ultime sono state sottoposte allo stesso trattamento delle KO ma includendo una sequenza di gRNA che non ha come bersaglio alcun gene umano. Le cellule sono state sottoposte a frazionamento subcellulare e l’analisi proteomica quantitativa è stata eseguita sulle frazioni mitocondriale, citosolica e nucleare tramite un approccio di tipo label free basato sulla cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS). I dati così ottenuti sono stati normalizzati ed analizzati per individuare le proteine con differente abbondanza nei tre genotipi così da mettere in evidenza le alterazioni tra le cellule KO e le cellule di controllo. I risultati mostrano come la delezione del gene codificante per Grx2 comporti in entrambe le linee cellulari forti alterazioni in numerosi processi biologici quali ad esempio il binding di proteine e RNA processi biosintetici e catabolici, ubiquitinazione e vie di secrezione vescicolare. L’insieme dei dati ottenuti mostra peculiarità dipendenti dalla linea cellulare ma anche alterazioni che interessano processi biologici comuni, nonostante il numero estremamente ridotto di proteine che risultano alterate in entrambe le linee cellulari. I dati ottenuti permettono di chiarire meglio il ruolo di Grx2 e di evidenziare processi cellulari nei quali il coinvolgimento di Grx2 non era ancora stato ipotizzato.