PEPTIDE-BASED NANOPARTICLES FOR SPECIFIC CELL-TARGETED GENE DELIVERY

In recent years, the use of messenger RNA (mRNA) as a therapeutic agent has attracted strong interest in the biomedical sciences. The main challenges in the use of mRNA are strictly related to its direct transport to target cells and possible degradation by RNAsi. On the other hand, applications of mRNA technology range from vaccines against viruses to strategies against infections, cancers, cardiovascular disease, and difficult-to-treat neurological diseases, and in the development of innovative biomaterials. In recent years, various types of nanoparticles have shown the ability to bind these oligonucleotide sequences, in particular, lipid nanoparticles were developed during the recent COVID-19 pandemic and allowed safe, efficient, and stable delivery of target mRNA sequences, not without side effects such as possible toxicity and stability problems related to the degradation of the nanoparticles themselves. This thesis aims to synthesize peptide-based nanoparticles that allow the specific delivery of oligonucleotide sequences of interest, thus obviating the problems presented by lipid nanoparticles. In particular, the diphenylalanine peptide was chosen as the self-assembled unit in this thesis work. Exploiting this peptide sequence as a self-assembling core, two different conjugates were subsequently created, peptide nucleic acid (PNA) model (GGG)-FF conjugate and RGD-FF conjugate, which allowed, respectively, the transport of a complementary oligonucleotide sequence and specific cellular targeting via binding with integrins receptors. SEM analyses were carried out and showed that the use of different mixtures of the above sequences led to the formation of spherical nanoparticles with increasing size as the amount of PNA model (GGG)-FF and RGD-FF conjugates used increased. A confocal microscope bioassay was performed to assess the ability of the RGD-FF conjugate to specifically bind transmembrane integrins receptors. FT-IR analysis and XPS analysis were carried out to evaluate the chemical composition of 4 different types of nanoparticles. In particular, the nanoparticles obtained from the following different mixtures were analysed: FF, PNA model (GGG)-FF conjugate, FF/PNA model (GGG)-FF conjugate (1:1 ratio) and FF/PNA model (GGG)-FF/RGD-FF conjugates (1:1:1 ratio).

Negli ultimi anni, l'uso dell'RNA messaggero (mRNA) come agente terapeutico ha suscitato un forte interesse nelle scienze biomediche. Le principali sfide nell'uso dell'mRNA sono strettamente legate al suo trasporto diretto verso le cellule bersaglio e alla sua possibile degradazione. D’altro canto, le applicazioni della tecnologia dell’mRNA spaziano dai vaccini contro i virus alle strategie contro le infezioni, i tumori, le malattie cardiovascolari, malattia neurologiche difficili da trattare chirurgicamente e nella messa a punto di biomateriali innovativi. Negli ultimi anni, vari tipi di nanoparticelle hanno dimostrato la capacità di legare queste sequenze oligonucleotidiche, in particolare le nanoparticelle lipidiche sono state sviluppate durante la recente pandemia di covid-19 e hanno permesso una consegna sicura, efficiente e stabile delle sequenze di mRNA target. Ma purtroppo non senza effetti collaterali come la possibile tossicità e i problemi di stabilità dell’RNA legati alla degradazione delle nanoparticelle stesse. Lo scopo di questa tesi è quello di sintetizzare nanoparticelle a base di peptidi che permettano la consegna specifica di sequenze oligonucleotidiche di interesse, ovviando così ai problemi presentati dalle nanoparticelle lipidiche. In particolare, in questo lavoro di tesi è stato scelto il dipeptide FF come unità auto-assemblante. Sfruttando questa sequenza peptidica come nucleo auto-assemblante, sono stati successivamente creati due diversi coniugati, il coniugato peptide nucleic acid (PNA) modello (GGG)-FF e il coniugato RGD-FF, che hanno permesso, rispettivamente, il trasporto di una sequenza oligonucleotidica complementare e il targeting cellulare specifico attraverso il legame con le integrine. Le analisi al SEM hanno dimostrato che l'uso di diverse miscele delle sequenze sopra citate ha portato alla formazione di nanoparticelle sferiche con dimensioni crescenti all'aumentare della quantità di coniugati PNA modello (GGG)-FF e RGD-FF utilizzati. È stato eseguito un test biologico al microscopio confocale per valutare la capacità del coniugato RGD-FF di legare specificamente le integrine transmembrana. Sono state effettuate analisi FT-IR e XPS per valutare la composizione chimica di 4 diversi tipi di nanoparticelle. In particolare, sono state analizzate le nanoparticelle ottenute dalle seguenti diverse miscele: FF, PNA modello (GGG)-FF coniugato, FF/PNA modello (GGG)-FF coniugato (rapporto 1:1) e FF/PNA modello (GGG)-FF/RGD-FF coniugati (rapporto 1:1:1).