Valutazione preclinica in vitro di Doxorubicina liposomiale direzionata mediante il Fab di atezolizumab per la terapia del carcinoma epatocellulare

Il carcinoma epatocellulare (HCC) è uno dei tumori più diffusi a livello globale e una delle principali cause di mortalità correlata al cancro in tutto il mondo. Diversi fattori di rischio sono implicati nello sviluppo dell'HCC, con una predominanza di infezioni virali (HBV, HCV) in Asia, steatosi epatica non alcolica (NAFLD), steatoepatite non alcolica (NASH) e abuso di alcol in Europa e Nord America. Durante la progressione del tumore, le cellule stromali perdono la loro funzione di mantenimento dell'omeostasi e promuovono l'evasione immunitaria e l'espansione delle cellule cancerose. In questo contesto, le cellule immunitarie giocano un ruolo importante nello sviluppo e nella progressione del carcinoma epatocellulare, in particolare i macrofagi associati al tumore (TAMs) che, a seconda del fenotipo assunto, possono avere un'azione antitumorale (macrofagi di tipo M1) o pro-tumorale (macrofagi di tipo M2). Se diagnosticato nelle fasi iniziali, l'epatocarcinoma è curabile con trattamenti locoregionali. Tuttavia, l'HCC viene solitamente diagnosticato in stadi avanzati, quando il tumore non è resecabile: in tali casi, la terapia sistemica è l'unico modo per procedere. L'immunoterapia è recentemente diventata un metodo promettente per inibire la progressione, la recidiva e le metastasi dell’HCC. Gli inibitori dei checkpoint immunitari (ICIs) sono attualmente il trattamento immunoterapico di maggior successo per l'epatocarcinoma. L'uso di ICI consente di ripristinare la risposta immunitaria contro le cellule tumorali, che possono quindi essere efficacemente distrutte. ICI atezolizumab è un anticorpo monoclonale che si lega e inibisce il ligando della proteina di morte cellulare programmata 1 (PDL-1). Questo checkpoint immunitario sembra essere sovra espresso da cellule tumorali, cellule immunitarie esauste che hanno perso la capacità di innescare risposte immunitarie difensive e macrofagi di tipo M2. Il primo obiettivo è stato quello di impostare un protocollo per lo sviluppo di sferoidi 3D HepG2 e successivamente un confronto tra due diversi modelli di crescita della coltura cellulare 3D del tumore, per validare quale fosse il migliore in relazione all'uso per esperimenti in vitro. Il secondo obiettivo è stato quello di validare sugli sferoidi HepG2 l'efficacia di due formulazioni terapeutiche per il trattamento dell'HCC. La prima formulazione, denominata SIL, è un immunoliposoma contenente doxorubicina (DXR) e funzionalizzato in superficie con il Fab dell'anticorpo monoclonale Atezolizumab, diretto verso l'antigene PDL-1. Questa formulazione è stata testata e confrontata con una formulazione liposomiale non direzionata chiamata SL, a cui manca solo il frammento Fab di atezolizumab. Le due formulazioni in esame sono state prima testate sul modello di sferoide HepG2 per valutare il loro effetto sull'indice di sfericità (SI), sul volume e sulla vitalità cellulare, mediante il test CellTiter-Glo® 3D Cell Viability. Entrambe le formulazioni hanno mostrato un effetto citotossico sullo sferoide HepG2, diminuendo la vitalità cellulare e anche i due parametri misurati, volume sferoide e indice di sfericità rispetto allo sferoide HepG2 non trattato, utilizzato come controllo. In secondo luogo, è stato valutato l'effetto delle due formulazioni sulla polarizzazione di THP-1 in co-coltura con sferoidi HepG2. Il trattamento SIL ha aumentato significativamente la polarizzazione di THP-1 verso il fenotipo M1 antitumorale rispetto al controllo e agli sferoidi trattati con SL e ha ridotto efficacemente la vitalità sferoide senza influire sull'indice di sfericità. In conclusione, si è vista un’efficacia significativa dei due trattamenti sulla regressione tumorale rispetto ai controlli non trattati; si è notata un’efficacia maggiore nella diminuzione dei macrofagi di tipo M2 pro-tumorali con il trattamento SIL rispetto al trattamento SL.