Valutazione del coinvolgimento dei long non-coding RNA nello sviluppo della sclerosi laterale amiotrofica: il loro ruolo nella modulazione della funzionalità mitocondriale.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease that leads to the deterioration of motor neurons, preventing voluntary and involuntary muscle stimulation leading to death. The course and progression of the disease are highly variable as it is a late onset disease characterized by progressive motor symptoms such as muscle weakness, muscle atrophy and spasticity. The causes of the development of the pathology remain largely unknown and therapeutic options are ineffective in the long term. Several studies suggest that non-coding RNAs are central to the onset of ALS. Accumulating evidence suggests that molecular alterations in muscle fibers in the pre-symptomatic phase may trigger the pathology. The use of RNA for therapeutic purposes represents a potential innovation for the treatment of neuromuscular pathologies. For an approach based on the modulation of the expression of non-coding RNAs for therapeutic purposes, it is of fundamental importance to understand the function of the RNAs themselves. In this thesis some long non-coding RNAs whose expression is altered in the muscle of a mouse model of ALS have been considered and their functions in muscle cells have been studied. To investigate the correlation between the expression of specific lncRNAs and the onset of ALS, expression vectors capable of expressing the AIRN and SNHG18 lncRNAs were constructed. This allowed transfecting with vectors constructed of C2C12 cells, which mimic skeletal muscle functioning, to allow overexpression of lncRNAs. Once transfected, C2C12 cells were analyzed using an unbiased transcriptomics approach which allowed to highlight which pathways were altered by the modulation of lncRNA expression. One of the main alterations that have been highlighted is linked to mitochondrial metabolism. This allowed us to focus attention on specific genes involved in the regulation of the mitochondrion structure, highlighting their altered expression using qRT-PCR techniques. By co-transfecting C2C12 with the previously described vectors and with a vector that allows the synthesis of a fluorescent protein localizing in the mitochondria, it is possible to verify the structure of the mitochondrial network. This technique allowed us to confirm the alteration of the mitochondrial network in cells that express lncRNAs in an altered way in relation to the variation of expression of genes involved in the regulation of mitochondrial fusion and fission. From the data obtained, it can be seen that AIRN and SNHG18 play a crucial role in the morphological changes of mitochondria that are potentially related to the onset of ALS. It is therefore possible to design and develop a specific therapy for each patient based on the use of lncRNA to respond to the negative effects of the disease. In fact, the first lncRNA promotes mitochondrial fragmentation, while the second reduces it.

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa che porta al deterioramento dei moto neuroni, impedendo la stimolazione della muscolatura volontaria e involontaria portando alla morte. Il decorso e la progressione della malattia sono molto variabili essendo una patologia ad insorgenza tardiva, caratterizzata da sintomi motori progressivi quali debolezza muscolare, atrofia muscolare e spasticità. Le cause di sviluppo della patologia restano in gran parte sconosciute e le opzioni terapeutiche sono inefficaci a lungo termine. Diversi studi suggeriscono che gli RNA non codificanti sono fondamentali per l'insorgenza della SLA. Sempre più evidenze suggeriscono che alterazioni molecolari nelle fibre muscolari nella fase pre-sintomatica possono innescare la patologia. L’utilizzo di RNA a scopo terapeutico rappresenta una potenziale innovazione per il trattamento delle patologie neuromuscolari. Per un approccio basato sulla modulazione dell’espressione degli RNA non codificanti a fini terapeutici è di fondamentale importanza comprendere la funzione degli RNA stessi. In questa tesi verrà sono stati considerati alcuni long non-coding RNA la cui espressione è alterata nel muscolo di un topo modello della SLA e se ne sono studiate le funzioni nelle cellule muscolari. Per indagare la correlazione tra l’espressione di specifici lncRNA e l’insorgenza della SLA sono stati costruiti dei vettori di espressione in grado di esprimere i lncRNA AIRN e SNHG18. Questo ha permesso di trasfettare con i vettori costruiti delle cellule C2C12, che mimano il funzionamento del muscolo scheletrico, per permettere l’overespressione dei lncRNA. Una volta trasfettate, le cellule C2C12 sono state analizzate mediante un approccio unbiased di trascrittomica che ha permesso di evidenziare quali fossero i pathway alterati dalla modulazione dell’espressione dei lncRNA. Una delle alterazioni principali che sono state evidenziate è legata al metabolismo mitocondriale. Questo ha permesso di focalizzare l’attenzione su specifici geni coinvolti nella regolazione della struttura del mitocondrio evidenziando mediante tecniche di qRT-PCR la loro alterata espressione. Co-trasfettando le C2C12 con i vettori precedentemente descritti e con un vettore che permette di sintetizzare una proteina fluorescente che localizza nei mitocondri è possibile verificare la struttura del network mitocondriale. Questa tecnica ha permesso di confermare l’alterazione del network mitocondriale nelle cellule che esprimono in modo alterato i lncRNA in relazione alla variazione di espressione dei geni coinvolti nella regolazione della fusione e fissione dei mitocondri. Dai dati ottenuti si evince come AIRN e SNHG18 abbiano un ruolo cruciale nei cambiamenti morfologici dei mitocondri che sono potenzialmente correlati all’insorgenza della SLA. È quindi possibile ideare e sviluppare una terapia specifica per ogni paziente basata sull’utilizzo di lncRNA per rispondere agli effetti negativi della malattia, Infatti, il primo lncRNA promuove la frammentazione mitocondriale, mentre il secondo la riduce.