INVESTIGATION OF CXCR4-CXCL12 AXIS IN A BIOENGINEERED HUMAN NEUROMUSCULAR SYSTEM IN VITRO MODEL.

Skeletal muscle is a highly dynamic tissue responsible for locomotion, posture maintenance and force generation, whose three-dimensional architecture is strictly associated to its function. Moreover, skeletal muscle function is controlled by a specific class of central nervous system neurons, known as motor neurons. With recent advances in bioengineering and stem cell technology, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be used to derived human neuromuscular system in vitro models, providing an important tool for basic research and for developing regenerative medicine strategies for congenital or traumatic disorders that affect skeletal muscle, as well as the neuromuscular system. The mechanisms that govern human neuromuscular system development and regeneration in health and disease are largely unknown. In this thesis, we investigated the CXCR4-CXCL12 axis, a pathway which, in animal models, is involved in both embryonic development and regeneration of skeletal muscle and innervation. To do so, we used a small-molecule-based protocol to guide the differentiation of hiPSCs into neuromesodermal progenitors that can give simultaneously rise to both skeletal muscle and motor neurons. The neuromuscular models were derived in both conventional two-dimensional cell culture condition and within synthetic scaffolds characterized by a bioengineered microchannel topography. To investigate the CXCR4-CXCL12 axis, we implemented in our human neuromuscular system models two already published small molecules able to activate or inhibit this pathway. In particular, we used AMD3100, a non-peptide molecule which acts as a specific CXCR4 receptor antagonist, and NUCC 390, a non-peptide organic molecule synthesized as an analogue of the endogenous chemokine CXCL12. Our experiments revealed that the CXCR4-CXCL12 axis influence both muscular and neuronal morphogenesis during the early stages of neuromuscular system differentiation in our human in vitro models. In particular, inhibition of the pathway induced significant reduction of the myogenic cell size and neural axon length, together with reduced parallel organization of the myogenic cells and bundles of neural projections. Finally, since the application of mechanical stimulation contributes to the proper growth and anisotropic organization of skeletal muscle, a novel soft-tissue specific bioreactor was produced and characterized with the aim to apply in the future dynamic culture conditions to our neuromuscular models.

Il muscolo scheletrico è un tessuto altamente dinamico responsabile della locomozione, del mantenimento della postura e della generazione di forza, la cui architettura tridimensionale è strettamente associata alla sua funzione. Inoltre, la funzione del muscolo scheletrico è controllata da una classe specifica di neuroni del sistema nervoso centrale, noti come motoneuroni. Grazie ai recenti progressi della bioingegneria e della tecnologia delle cellule staminali, le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) possono essere utilizzate per derivare modelli in vitro del sistema neuromuscolare umano, fornendo un importante strumento per la ricerca di base e per lo sviluppo di strategie di medicina rigenerativa per i disturbi congeniti o traumatici che colpiscono il muscolo scheletrico e il sistema neuromuscolare. I meccanismi che regolano lo sviluppo e la rigenerazione del sistema neuromuscolare umano in condizione fisiologica e patologica sono in gran parte sconosciuti. In questa tesi, abbiamo studiato l'asse CXCR4-CXCL12, una via, che nei modelli animali, è coinvolta sia nello sviluppo embrionale che nella rigenerazione del muscolo scheletrico e nell'innervazione. A tal fine, abbiamo utilizzato un protocollo basato su piccole molecole per guidare il differenziamento di hiPSCs in progenitori del neuromesoderma che possono dare origine alternativamente a muscolo scheletrico e motoneuroni. I modelli neuromuscolari sono stati ottenuti sia in condizioni convenzionali di coltura cellulare bidimensionale sia all'interno di scaffold sintetici caratterizzati da una topografia bioingegnerizzata con microcanali. Per studiare l'asse CXCR4-CXCL12 abbiamo utilizzato nei nostri modelli di sistema neuromuscolare umano due molecole già pubblicate in grado di attivare o inibire questa via. In particolare, abbiamo usato AMD3100, una molecola non peptidica che agisce come antagonista specifico del recettore CXCR4, e NUCC 390, una molecola organica non peptidica sintetizzata come analogo della chemochina endogena CXCL12. I nostri esperimenti hanno rivelato che l'asse CXCR4-CXCL12 influenza la morfogenesi muscolare e neuronale durante le prime fasi di differenziamento del sistema neuromuscolare nei nostri modelli umani in vitro. In particolare, l'inibizione della via ha indotto una riduzione significativa delle dimensioni delle cellule miogeniche e della lunghezza degli assoni neurali, insieme ad un’inferiore organizzazione parallela delle cellule miogeniche e dei fasci di proiezioni neurali. Infine, poiché l'applicazione della stimolazione meccanica contribuisce alla corretta crescita e all'organizzazione anisotropa del muscolo scheletrico, è stato prodotto e caratterizzato un nuovo bioreattore specifico per i tessuti molli, con l'obiettivo di applicare in futuro condizioni di coltura dinamiche ai nostri modelli neuromuscolari.