Investigating the role of Beclin-1 in Schwann cell maturation and development in vivo

Autophagy is a fundamental cellular process involved in the maintenance of cell homeostasis and with a pro-survival role in different non-physiological conditions like starvation or infections. In Schwann cells (SCs), the role of autophagy is essential for a correct development and for peripheral nerve regeneration after injury. Beclin-1 is a key protein in the autophagic pathway and endosomal trafficking but its role in the SCs was never investigated. Here, I contributed to the characterization of a new murine model with a SC-specific ablation of Becn1. The model, from a first phenotypical characterization, displayed involuntary tremors, motor impairment, peripheral nerve demyelination, and radial sorting defects. In this work, I demonstrated that the loss of Beclin-1 in SCs causes a block of the autophagic flux not in terms of autophagosome formation, rather than of reduced autophagic degradation. The accrual of autophagy-related targets together with a remarkable accumulation of cytosolic vesicles detectable in Becn1 cKO SCs, points to a major contribution in demyelination from an impaired endocytic trafficking, in which Beclin-1 is also physiologically involved. The demyelination and the loss of contact between SCs and axons resulted in a secondary motor axonal loss, as usually observed in patients with demyelinating neuropathies. Moreover, in the peripheral nerve of Becn1 cKO animals, I detected the presence of an inflammatory infiltrate that could be associated with the observed myelin-related axonal loss. While motor impairment was clearly evident in this model, the observed radial sorting defect was a hint to further analyze a possible involvement of the sensory compartment. For this reason, dorsal root ganglia, the neuronal bodies of the sensory axons were also analyzed. From these analyses the presence of neuroinflammation and neuronal response to an injury-like status could be clearly detected. These results highlighted impairments also in the sensory compartment and were confirmed by the sensory loss displayed by Becn1 cKO mice during the hot plate test. The motor axonal loss and motor impairment suggested that neurodegeneration and neuroinflammation were present also at the motor neurons level. Analyses performed on the spinal cord confirmed the presence of inflammatory cells-related transcripts and injury-like neuronal response. Altogether these data showed that the SC-specific ablation of Beclin-1 in mice induced a demyelinating neuropathic phenotype. Future investigation on the molecular mechanism underlying demyelination and on Beclin-1 interactors mediating the observed defects in SCs could lead to new therapeutic approaches for demyelinating neuropathies.

L'autofagia è un processo cellulare coinvolto nel mantenimento dell'omeostasi e nel garantire la sopravvivenza della cellula in diverse condizioni non fisiologiche come il digiuno o le infezioni. Nelle cellule di Schwann (SCs), il ruolo dell'autofagia è essenziale per un corretto sviluppo e per la rigenerazione del nervo periferico in seguito ad una lesione. Beclin-1 è una proteina chiave nel processo autofagico e nel traffico endosomiale, ma il suo ruolo nelle SCs non è mai stato investigato. In questo lavoro di tesi, ho contribuito alla caratterizzazione di un nuovo modello murino con un'ablazione di Becn1 SC-specifica. Da una prima caratterizzazione fenotipica, tale modello, ha manifestato tremori involontari, deficit motori, demielinizzazione dei nervi periferici e difetti nel processo di radial sorting. In questo progetto, ho dimostrato che la perdita di Beclin-1 nelle SCs causa un blocco del flusso autofagico non tanto in termini di formazione di autofagosomi, quanto di ridotta degradazione autofagica. L'accumulo di marcatori proteici, normalmente degradati via autofagia, insieme a un notevole accumulo di vescicole citosoliche, rilevabile nelle SCs dei topi knockout condizionali per Becn1, indica il contributo importante alla demielinizzazione di un alterato traffico endosomiale, in cui Beclin-1 è fisiologicamente coinvolto. Come osservabile nei pazienti con neuropatie demielinizzanti, in assenza di Beclin-1 nelle SCs, si riscontra una perdita secondaria di assoni motori nei nervi periferici, coerentemente con la demielinizzazione osservata e con l’attesa perdita di contatto tra le SCs e gli assoni. Inoltre, nei topi knockout condizionali per Becn1 ho rilevato la presenza di un infiltrato infiammatorio associabile alla perdita assonale osservata. Sebbene la compromissione motoria fosse chiaramente evidente in questo modello, il difetto osservabile nel processo di radial sorting, importante nello sviluppo delle fibre sensoriali, è stato un suggerimento per analizzare un possibile coinvolgimento del comparto sensoriale. Per questo motivo, sono stati analizzati anche i gangli delle radici dorsali, contenenti i corpi neuronali degli assoni sensoriali. Da queste analisi è stato possibile rilevare chiaramente la presenza di infiammazione e una risposta neuronale comparabile a quella causata da danno. Questi risultati hanno messo in luce una compromissione anche del comparto sensoriale e sono stati confermati dalla perdita di funzionalità sensoriale mostrata dai topi Becn1 cKO durante l’hot plate test. La perdita di assoni motori e la compromissione delle funzioni motorie hanno suggerito che la neurodegenerazione e la neuroinfiammazione fossero presenti anche a livello dei motoneuroni. Le analisi effettuate sul midollo spinale hanno confermato la presenza di trascritti relativi ad infiltrato infiammatorio e una risposta neuronale simile a quella riscontrata in caso di lesione. Complessivamente, questi dati hanno dimostrato che, l'ablazione specifica di Beclin-1 nelle SCs, ha indotto nel topo un fenotipo neuropatico demielinizzante. Le future indagini sul meccanismo molecolare alla base della demielinizzazione e sui partner di interazione di Beclin-1, che mediano i difetti osservati nelle SCs, potrebbero portare a nuovi approcci terapeutici per le neuropatie demielinizzanti.