Progettazione di proteine di fusione per il surface display nel cianobatterio Synechocystis sp. PCC 6803

La biocatalisi utilizza catalizzatori biologici, come enzimi o intere cellule, per catalizzare reazioni chimiche. Questo è un settore in forte espansione poiché mostra molteplici potenzialità nello sviluppo di prodotti di interesse industriale. Inoltre sono numerosi i vantaggi forniti dai biocatalizzatori che sono altamente selettivi e specifici, lavorano in condizioni blande, e il loro utilizzo è compatibile con altri principi della green chemistry. I cianobatteri sono tra gli organismi attualmente più interessanti e vengono studiati per la biosintesi di prodotti di interesse industriale grazie alla loro abilità di fissare l’anidride carbonica e ricavare energia dalla luce. Un cianobatterio largamente impiegato e ingegnerizzato, nonché organismo modello, è Synechocystis sp. PCC 6803, il quale può essere utilizzato come cell factory per fare biocatalisi whole cell, ed è comunemente adottato per lo studio della produzione di biocarburanti, bioplastiche, pigmenti e prodotti farmaceutici. La biocatalisi whole cell, però, presenta dei limiti, tra cui quello legato alla permeabilità della membrana: infatti, non tutti i substrati e i prodotti possiedono dimensioni e caratteristiche chimico-fisiche adeguate per permearla. Una possibile strategia per superare questo limite è il surface display che consiste nell’espressione di enzimi o proteine di interesse sulla superficie cellulare. Pertanto in questo lavoro di tesi è stata indagata la possibilità di indirizzare enzimi utili per la biocatalisi sulla superficie della membrana esterna di Synechocystis sp. PCC6803 mediante l’utilizzo di costrutti di fusione. Tali costrutti di fusione sono composti da un dominio àncora, un linker e un dominio catalitico che può essere costituito da un qualsiasi enzima di interesse. Il dominio àncora, che ha lo scopo di ancorare il costrutto alla membrana esterna del cianobatterio, è costituito da domini di proteine naturalmente espresse in Synechocystis sp. PCC6803 e localizzate sulla membrana esterna. Il focus di questo lavoro è stato la ricerca e l’analisi di tali domini, e la realizzazione di costrutti di fusione con lo scopo di testare le ancore utilizzando come dominio catalitico delle proteine paradigmatiche: YFP e GST. Le ancore sono state testate attraverso la creazione di ceppi transgenici mediante il clonaggio delle sequenze codificanti le proteine di fusione in due vettori universali che favoriscono l’integrazione cromosomica e la successiva espressione di proteine ricombinanti in Synechocystis sp. PCC6803: pSuperP560_UniversalVector e pZia_UniversalVector, precedentemente costruiti nel laboratorio della Prof.ssa Bergantino.