NEW INSIGHTS INTO THE CHARACTERIZATION AND REGULATION OF DEOXYNUCLEOTIDE METABOLISM IN HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have opened up the possibility to design new therapeutical approaches, given their capacity to self-renew indefinitely and to differentiate into any cell type. Harnessing this technology is not without its challenges, one of which is to promote long-term culturing. During long-term expansion and reprogramming, hPSCs may accumulate recurrent genetic variants. Nevertheless, mechanisms that drive this hPSCs genomic instability and its progression are currently unknown. Since replication and repair of DNA require adequate amounts of each deoxynucleotide (dNTP) and appropriately balanced dNTP pools, the availability of dNTPs is critical for genome stability, both in replicating and quiescent cells. However, current understanding of dNTP metabolism in hPSCs is still limited. The present study discusses new insights into the characterization and regulation of dNTP metabolism in human induced pluripotent stem cells derived from keratinocytes (KiPSCs). Here is outlined the progress that has been made in figuring out which factors control dNTP pool availability when KiPSCs are kept in culture. Transcriptomics data and gene expression analysis of enzymes involved in dNTP metabolism were integrated and related to enzymatic activity assays. We found a different mitochondrial dNTP enzyme regulation in KiPSCs than in BJ fibroblasts. Together with a reduced expression of TK2, we observed an increased expression of DGUOK and NT5M, thus hinting at a boost of purine synthesis in KiPSCs, confirmed by mitochondrial dNTP pools quantification analysis. Despite the lower reliance on oxidative phosphorylation, mitochondrial DNA copy number in KiPSCs was higher compared with BJ fibroblasts.

Le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) hanno la capacità di dividersi indefinitamente e di dare origine a tutti i tipi cellulari del corpo umano, rappresentando uno strumento promettente nell’ambito della medicina rigenerativa. Tuttavia, quando mantenute in coltura per tempi prolungati o durante riprogrammazione, le hPSCs sono soggette a mutazioni. E’ noto che i processi di replicazione e riparazione del DNA richiedano adeguati livelli di ciascun deossinucleotide (dNTP). Per questo, la disponibilità dei dNTPs è considerata un fattore critico per la stabilità genomica, sia in cellule proliferanti che quiescenti. Attualmente, il metabolismo dei dNTP nelle hPSCs è ancora poco conosciuto. In questa tesi si presentano i nuovi progressi riguardo la caratterizzazione e regolazione del metabolismo dei dNTP nelle cellule staminali pluripotenti indotte derivanti da cheratinociti (KiPSCs). Si riportano i recenti sviluppi riguardo i fattori che controllano la disponibilità dei dNTPs, quando le KiPSCs sono mantenute in coltura. I dati di trascrittomica degli enzimi coinvolti nel metabolismo dei dNTP sono stati integrati con le analisi di espressione genica e correlati ai saggi di attività enzimatica. Nelle KiPSCs abbiamo riscontrato una differente regolazione enzimatica a livello mitocondriale, rispetto ai fibroblasti BJ. Abbiamo evidenziato un decremento di espressione di TK2 ed un incremento di DGUOK e NT5M, che suggeriscono un aumento di sintesi di purine nelle KiPSCs, come confermato dalla quantificazione del pool dei dNTP mitocondriali. Inoltre, nonostante dipendano poco dalla fosforilazione ossidativa, abbiamo osservato un elevato numero di copie di DNA mitocondriale nelle KiPSCs rispetto ai fibroblasti BJ.